I marcatori genetici

Elementi di genetica di
base
e marcatori molecolari
Dott.ssa Marica Soattin
Organismi animali
costituiti da cellule di tipo eucariote
Cellule con nucleo differenziato
delimitato da membrana e organelli
subcellulari (es. mitocondri)
Genoma: l’insieme del materiale
ereditario contenuto in una cellula
Cromosomi
Specie
2n=2x
Cromosoma
Uomo
46
Unità strutturale e colorabile dei nuclei che porta
i geni disposti in modo lineare. Considerato
anche come un insieme di geni (gruppo di
associazione) organizzati secondo una
successione lineare che tendono ad essere
ereditati insieme.
Bovino
60
Suino
36
Ovino
54
Cavallo
64
Cane
78
Nelle specie a determinazione
cromosomica del sesso si
distinguono:
Autosomi
Cromosomi sessuali
Tutti i cromosomi non
sessuali
Determinano il sesso di un individuo
Mammiferi: XX femmina, XY maschio
Uccelli: ZW femmina, ZZ maschio
Cariotipo
Numero, dimensione e morfologia dei cromosomi metafasici
caratteristico di ciascuna specie
Cariotipo umano
Struttura dei cromosomi
Telomero
Eterocromatina: regioni fortemente
condensate e intensamente colorabili
del cromosoma eurcariotico.
Generalmente presente a livello dei
centromeri e telomeri.
Centromero
Eucromatina: regioni poco
condensate sparse lungo i bracci
del cromosoma eucariotico che
sono attive in termini di trascrizione
Telomero
Visualizzazione cromosomi: tecniche
FISH e GISH
Numeri cromosomico…
somatico 2n: numero di cromosomi
contenuti nelle cellule somatiche
gametico n: numero di cromosomi
contenuti nei gameti maschili e
femminili
2n è dunque costituito da due corredi cromosomici: n di origine materna
e n di origine paterna
madre
Coppia di omologhi
padre
Materiale ereditario
DNA (acido deossiribonucleico): doppia elica destrosa
con due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte
l’una sull’altra in una spirale che costituisce il materiale
genetico.
Ogni filamento è formato da una successione monotona di
gruppi fosfato e zuccheri pentosi (deossirbosio) con le 4
basi azotate (A, T, G, C) situate perpendicolarmente
all’asse dell’elica e sono tenute insieme a quelle dell’altro
filamento da legami H:
A con T (2 legami)
C con G (3 legami)
Il DNA è dunque in grado di duplicarsi: una
catena funge da stampo per la sintesi dell’altra
in presenza dell’enzima DNA polimerasi
MECCANISMO ALLA BASE DELL’EREDITARIETA’
DNA
contiene l’informazione necessaria per la nascita, lo sviluppo e il
mantenimento degli organismi viventi
GENE: Frazione di DNA che presiede alla sintesi di una particolare
catena polipeptidica attraverso uno specifico mRNA intermedio
Unità ereditaria fisica e funzionale responsabile del trasferimento
dell’informazione genetica da una generazione alla successiva
e della manifestazione fenotipica dei caratteri.
Ogni cellula possiede il corredo genetico completo ma a seconda
del tessuto a cui appartiene, geni diversi si attivano e vengono
trascritti e quindi tradotti in proteine
es. geni proteine latte
sono attivi solo nelle femmine e nelle cellule della ghiandola mammaria
ALLELE una delle possibili forme alternative di un gene
presente in una specifica localizzazione
cromosomica (locus)
LOCUS sito occupato da un gene nel cromosoma
Locus INRA023
Omozigote: individuo che presenta la stessa forma allelica in loci
corrispondenti di cromosomi omologhi
Eterozigote: individuo che presenta forme alleliche diverse in loci
corrispondenti di cromosomi omologhi
Es. L’allele A codifica per il NERO; a per il ROSSO
Omozigoti: AA o aa
Eterozigoti: Aa
L’informazione genetica (GENOTIPO)
determina un carattere visibile dell’animale
(FENOTIPO)
Individuo AA: doppia informazione per il colore nero
Individuo aa: doppia informazione per il colore rosso
Individuo Aa: informazione per entrambi i colori del mantello
MANTELLO
NERO
MANTELLO
ROSSO
???
Interazioni alleliche
DOMINANZA/RECESSIONE:
uno dei due alleli (dominante) “maschera” l’altro, che è detto recessivo;
A è dominante su a: mantello a macchie NERE
CODOMINANZA:
nell’eterozigote entrambi gli alleli si esprimono e sono “riconoscibili” nel
fenotipo; mantello a macchie ROSSE e NERE
DOMINANZA INCOMPLETA:
nell’eterozigote l’effetto dei due alleli si somma; mantello a macchie di
colore di colore intermedio fra rosso e nero
EPISTASIA:
il fenotipo è influenzato dall’interazioni alleliche di due o più geni
Esempio : gruppi sanguigni nell’uomo
Alleli possibili: A, B, 0
A e B sono fra loro codominanti
A e B sono dominanti rispetto a 0
Padre/Madre
A
B
0
A
AA
AB
A0
B
AB
BB
B0
0
A0
0B
00
Genotipi
AA, A0
BB, B0
AB
00
Fenotipi
A
B
AB
0
Caratteri qualitativi
Caratteri controllati in maniera semplice da uno o pochi geni
Es. presenza di corna
colore del guscio dell’uovo
Gli individui di una data popolazione possono essere assegnati ad una
categoria o ad un’altra. La variabilità è di tipo discontinuo. Le
osservazioni su una popolazione sono descritte da un istogramma di
frequenza
60
50
Fenotipo = Genotipo
40
Carattere in esame
30
20
10
0
Fenotipo1 Fenotipo2 Fenotipo3
Caratteri quantitativi
Per la maggior parte dei caratteri, il fenotipo è condizionato
dall’ambiente e quindi si considera valida la seguente regola
generale:
Fenotipo (P) = Genotipo (G) + Ambiente (E)
E = clima, alimentazione, età, …
Influenza limitata sui caratteri qualitativi
Influenza sostanziale sui caratteri quantitativi
I caratteri quantitativi presentano una variabilità di tipo continuo
Es. produzione di latte
spessore del grasso
Caratteri quantitativi
Caratteri la cui espressione dipende dall’azione di più geni
che presentano più varianti ciascuno
0 .3 5
0 .18
0 .3
0 .16
0 .14
0 .2 5
0 .12
0 .2
0 .1
0 .15
0 .0 8
0 .1
0 .0 6
0 .0 4
0 .0 5
0 .0 2
0
A
B
C
D
E
F
G
es. 1 gene, 7 varianti e 7 fenotipi diversi
0
A
B
C
D
E
F
G
H
I
L
M
N
O
P
es. Molti geni con x varianti, 14 fenotipi risultato
della combinazione dell’effetto di tali varianti
Più geni, più varianti, effetti
ambientali … la distribuzione
da discreta diventa
continua
Varianti alleliche
Misure di variabilità genetica
• Numero di alleli per un dato locus
• Numero di individui eterozigoti (Aa)
Responsabili del
POLIMORFISMO del
genoma
VARIABILITÀ
GENETICA
Classi di marcatori genetici
Morfologici
la variabilità è espressa a livello fenotipico:
- caratteri mendeliani (caratteri qualitativi)
Biochimici:
La variabilità è osservabile attraverso analisi biochimiche:
- gruppi sanguigni
- isoenzimi (forme alternative di uno stesso enzima, dette
isoforme, che svolgono la stessa funzione in un dato organismo anche
se possono differenziarsi per uno o più aminoacidi)
- proteine (del plasma, del latte etc.)
Molecolari:
La variabilità è osservabile a livello genomico
- SNP, microsatelliti, RFLP, AFLP, RAPD,……
Marcatori molecolari: definizione
Rilevano la diversità dovuta a mutazioni di regioni di DNA
omologhe in individui diversi appartenenti alla stessa specie o a
specie diverse.
Un marcatore molecolare può essere definito come quel locus
genomico, rilevabile con sonde (=probe) o inneschi (=primer)
specifici che, in virtù della sua presenza, contraddistingue in
modo caratteristico ed inequivocabile il tratto cromosomico con
il quale si identifica e le regioni che lo circondano alle estremità
5‘ e 3‘.
Marcatori molecolari: caratteristiche
Si basano sulla rilevazione di differenze (=polimorfismi)
nella sequenza nucleotidica del DNA , differenze dovute
ad inserzioni, delezioni, traslocazioni, duplicazioni,
mutazioni puntiformi ecc..
-
Non subiscono interferenze da parte dell’ambiente
-
Coprono qualsiasi parte del genoma permettendo di rilevare
differenze anche tra individui geneticamente simili e fenotipicamnete
indistinguibili
-
Non presentano effetti epistatici o pleiotropici
-
In molti casi sono codominanti consentendo così la distinzione
dell’eterozigote dall’omozigote
-
Strumenti di indagine estremamente efficaci ed affidabili e trovano
larga applicazione nella ricerca di base e in quella applicata.
Marcatori molecolari: riassumendo…
•
Non influenzati dall’ambiente
•
Analisi indipendenti da sesso ed età
•
Campioni di qualsiasi tessuto
•
Neutrali
•
Stabili
•
Numerosi
•
Polimorfici
•
Generalmente codominanti
•
Facili da monitorare
•
Analisi automatizzabili
Classi di marcatori molecolari
Basati su ibridazione di tipo Southern (Southern Blot Hybridization, SBH)
Basati sulla Reazione a Catena della Polimerasi (PCR, Polymerase
Chain Reaction)
Singolo-locus
SBH
RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
VNTR (Variable Number of Tandem Repeat)
PCR
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)
SAMPL (Selective Amplified Microsatellite Polymorphic locus)
S-SAP (Sequence Specific Amplification Polymorphism)
RAPD (Random Amplified Polymorphich)
AP-PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction)
Multi-locus
I-SSR (Inter-simple Sequence Repeat)
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)
SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
SSR (Simple Sequence Repeat)
SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Singolo-locus
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Kary B. Mullis ideatore nel 1986
Consente di sintetizzare ripetutamente (amplificare) per via enzimatica
uno specifico segmento di DNA situato tra due regioni di sequenza
nucleotidica nota, producendone un numero elevato di copie
attraverso una serie di reazioni di:
-denaturazione (95°C)
-appaiamento degli inneschi (primer) (40-68°C)
-polimerizzazione dei nuovi frammenti ad opera della Taq Polimerasi (72 °C)
La reazione viene effettuata in un termociclatore (Thermal Cycler)
I prodotti sono visualizzati in gel d’agarosio
Meccanismo della PCR
Amplificazione esponenziale
PCR: dalla teoria alla pratica..
Elettroforesi
Tecnica che permette di visualizzare e separare acidi nucleici e
proteine
Principio: i frammenti di DNA migrano attraverso un materiale
selettivo (es. gel di agarosio) che li separa in base alle
dimensioni (peso molecolare/lunghezza); frammenti più piccoli
migrano attraverso le maglie del gel più velocemente, quelli più
grandi si muovono più lentamente.
-
Pozzetti nei
quali viene
caricato il DNA
Direzione
campo
elettrico
+
Marker di peso
molecolare
Enzima di restrizione (endonucleasi di restrizione)
Enzima di origine batterica capace di tagliare molecole di DNA a doppia
elica in corrispondenza di una specifica sequenza nucleotidica (sito di
restrizione) producendo frammenti di dimensioni variabili.
↓
G AATT C
C TTAA G
Sito di taglio EcoRI
↑
↓
T CG A
A GC T
Sito di taglio TaqI
↑
Disponendo della sequenza di un frammento di DNA è possibile ottenere delle
mappe di restrizione
Marcatori che prevedono l’impiego di enzimi di
restrizione
RFLP, AFLP e AFLP-derivati
Evidenziano differenze a livello di siti di restrizione
dovuti a delezioni/inserzioni
Allele 1
Allele 2
X
Sequenza di taglio dell’enzima di restrizione
Caratteristiche AFLP e AFLP-derivati
• Numerosi e presenti in tutto il genoma
• Non richiedono conoscenza a priori di sequenze
genomiche per la costruzione dei primer
• Messa a punto più rapida, poco dispendiosa (tempo
e costi)
• Spesso si ricorre a marcatura radioattiva dei primer
• Bassa informatività per singolo marcatore (biallelici),
alta informatività per analisi
• Tempi di analisi più lunghi vs. microsatelliti
AFLP
Marcatore
polimorfico
Marcatore
monomorfico
MICROSATELLITI
Ripetizioni in tandem di corte sequenze di nucleotidi:
ACACACACACACACAC
GTGTGTGTGTGTGTGTGTG
CACCAC CAC CAC CAC
GATAGATA GATA GATA
(AC)n
(GT)n
(CAC)n
(GATA)n
Distribuite nel genoma in numero elevatissimo
Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero di
ripetizioni del motivo di base del microsatellite n
Le regioni fiancheggianti tali ripetizioni sono conservate
entro la specie e spesso anche tra le specie
MICROSATELLITI
Attraverso le regioni conservate è possibile costruire delle sonde
(primer) che permettono di rilevare queste regioni ripetute
La tecnica utilizzata per la loro rilevazione è la PCR
Analisi con microsatelliti
1) ESTRAZIONE DEL DNA
Sangue
Pelo
Feci Seme
2) PCR
Con primer specifici
che appaiano alle
regioni fiancheggianti
l’elemento ripetuto
3) ELETTROFORESI
Su gel di acrilammide
al 6-7%
DNA totale
Elettroforesi capillare
Il principio è lo stesso dell’elettroforesi
“classica”: i frammenti di DNA migrano
attraverso una resina selettiva all’interno di un
capillare che li separa in base alle dimensioni
(peso molecolare/lunghezza); frammenti più
piccoli migrano attraverso le maglie della resina
più velocemente, escono prima dal capillare e
vengono intercettati per primi dal sistema di
rivelazione.
Tale dispositivo emette un raggio luminoso che colpisce i frammenti di
DNA che, se marcati con molecole fluorescenti, a loro volta emettono
un segnale in uscita che viene registrato.
Il risultato è un elettroferogramma.
Elettroferogramma
L’intensità del segnale dipende dalla quantità di frammento e determina
l’area e l’altezza dei picchi
La lunghezza esatta del frammento (in paia di basi) viene determinata
confrontando i prodotti in esame con uno standard (ROX 400)
50 bp
100 bp
200 bp
290 bp
400 bp
MICROSATELLITI
• Numerosi e presenti in tutto il genoma
• Alto polimorfismo (multiallelici)
• Codominanti
• Facili da rilevare (analisi veloci, dopo che la
metodologia è stata messa a punto)
MICROSATELLITI
Messa a punto onerosa (tempo e costi)
è basata sull’individuazione della localizzazione genomica
(locus) del marcatore per la costruzione di primer locusspecifici
Tuttavia …
Attualmente, per le specie animali più studiate (bovini,
ovini, caprini) sono disponibili centinaia di marcatori
microsatellite già “mappati”
Inoltre la possibilità di “trasferimento” inter-specie, data la
conservazione delle sequenze fiancheggianti, li rende
applicabili anche a specie meno studiate es. ungulati
selvatici
SNPs (Single nucleotide polymorphisms)
Polimorfismi a livello di singoli nucleotidi
GAT CAG TTC GAT GTC
GAT CAG TTT GAT GTC
SNPs
Marcatori (di fatto) biallelici
1. Frequenza di sostituzione a livello di singole basi è bassa,
1x10-9-5x10-9 per nucleotide per anno (mammiferi)
Probabilità di due cambi di base indipendenti è molto
bassa
2. Prevalenza di due tipi di mutazione preferenziali:
transizioni (A<=>G) e (C<=>T)
(transizioni:trasversioni= 1:1.7 nell’uomo)
CpG nucleotidi sono soggetti a deaminazione della C in T
Alti livelli di SNPs in cui C<=>T e quindi nell’altro filamento
A<=>G
Caratteristiche SNPs
•
Numerosità (sono milioni)
•
Alta riproducibilità e accuratezza
•
Analisi è automatizzabile
•
Sono spesso contenuti nei geni espressi
•
•
Richiedono un lungo lavoro di messa a punto
(per l’individuazione del marcatore)
Ne servono molti di più in fase di
genotipizzazione (vs. microsatelliti ad es.)
Rilevazione dei marcatori SNPs
Sono visualizzati attraverso sequenziamento di prodotti
di PCR di campioni di DNA isolati da un certo numero di
individui geneticamente differenziati
oppure
Ricerca in silico interrogando le principali banche dati
genomiche e selezionando un certo num di seq
riconducibili ad un det gene clonato in individui diversi
della stessa specie
Sequenziamento
Fonte: Barcaccia 2007- Volume III
Aplotipo: definizione
Insieme di alleli marcatori a loci strettamente associati che
tendono ad essere ereditati in blocco e che consentono di
identificare un singolo genotipo in maniera univoca
Esempio di applicazione dei marcatori molecolari
FB4
E4
Marcatore I-SSR331150 co-segregante con il colore del fiore
F1