I marcatori genetici e loro
applicazioni nelle
produzioni animali
Dott.ssa Chiara Targhetta
LOCUS
localizzazione genomica unica all’interno
di un cromosoma; permette di definire
la posizione di un gene o di una qualsiasi
sequenza di DNA
ALLELE
una delle varie forme alternative di un
gene o di una sequenza di DNA in una
specifica localizzazione cromosomica
(locus)
Varianti alleliche
Responsabili del
POLIMORFISMO del
genoma
(VARIABILITÀ
GENETICA)
I marcatori genetici
Sono sequenze
polimorfiche (presentano più
varianti alleliche) che si trovano in un locus
specifico
all’interno
del
cromosoma;
si
comportano in modo mendeliano e sono di facile
rilevazione
Identificano regioni cromosomiche nelle quali
possono essere localizzati geni importanti la cui
segregazione è difficile o impossibile da seguire
I marcatori genetici
Poiché sono polimorfici possono essere utilizzati
per valutare la variabilità genetica presente nelle
specie e nelle popolazioni
Locus 1
Locus 2
I marcatori genetici infatti identificano in modo
semplice le mutazioni che si sono accumulate nel
corso della storia evolutiva delle popolazioni
I marcatori genetici
m1
m2
m1
m2
m3
m3
Essi
permettono
di
costruire
mappe
genomiche dette mappe di linkage, definite
in base alla frequenza di ricombinazione di
tali marcatori
Avendo a disposizione marcatori distribuiti
uniformemente sul genoma è possibile
seguire in modo indiretto la segregazione di
qualsiasi gene
Classi di marcatori genetici..
..rilevabili a vari livelli
a) livello morfologico:
- caratteri mendeliani (caratteri qualitativi)
b) livello biochimico:
- gruppi sanguigni
- isoenzimi
- proteine (del plasma, del latte etc.)
c) livello di DNA:
- SNP, microsatelliti, RFLP, AFLP, RAPD,……
Caratteristiche favorevoli dei
marcatori del DNA
•Non influenzati dall’ambiente
•Analisi indipendenti da sesso ed età
•Campioni di qualsiasi tessuto
•Neutrali
•Stabili
•Numerosi
•Polimorfici
•Generalmente codominanti
•Facili da monitorare
•Analisi automatizzabili
SNPs
Polimorfismi a livello di singoli nucleotidi
Variazioni di singole basi
GAT CAG TTC GAT GTC
GAT CAG TTA GAT GTC
Frequenza elevata (più dell’1%)
Molto abbondanti
Distribuiti in modo casuale
Caratteristiche SNPs
Numerosità (sono milioni)
Alta riproducibilità e accuratezza
Analisi è automatizzabile
Sono spesso contenuti nei geni espressi
Richiedono un lungo lavoro di messa a punto
(per l’individuazione del marcatore e del
metodo per la sua rilevazione)
Ne servono molti di più in fase di
genotipizzazione
MICROSATELLITI o SSR
(Simple Sequence Repeats)
Ripetizioni in tandem di corte sequenze di
nucleotidi:
(AC)n, o (GT)n o (CAC)n o (GATA)n
diditritetra- nucleotidi
Distribuite nel genoma animale in numero
elevatissimo
Il polimorfismo è molto elevato e deriva dal numero
di ripetizioni del motivo di base del microsatellite n
Le regioni fiancheggianti tali ripetizioni sono
conservate entro la specie e spesso anche a livello
interspecifico
MICROSATELLITI o SSR
Visualizzazione microsatelliti
1) ESTRAZIONE DEL DNA
DNA
Sangue
Pelo
Feci Seme
2) PCR
POLYMERASE CHAIN REACTION
Individuo A
3 paia di
cromosomi
omologhi
3) ELETTROFORESI
Individuo B
Individuo C
campione di controllo
PCR
(polymerase chain reaction)
Strumento per ottenere molte copie di una sequenza di DNA
La reazione di amplificazione avviene ad opera di un enzima,
la DNA polimerasi, e di sonde (primer) in grado di legarsi in
modo complementare alle regioni fiancheggianti la mia
sequenza bersaglio
Il processo di amplificazione avviene in tre fasi:
1) Denaturazione del DNA (94-95°C)
2) Ibridazione del primer ad una temperatura variabile da 45 a
65 °C a seconda della lunghezza e sequenza del primer
3) Estensione del frammento bersaglio (72 °C)
Tale ciclo si ripete n volte.
La reazione viene effettuata in un termostato programmabile
I prodotti possono essere visualizzati su un gel d’agarosio
Microsatelliti o SSR
AFLP
(amplified fragment lenght polimorphism)
Evidenziano polimorfismi di
restrizione, delezioni e inserzioni
Allele 1
Allele 2
X
Sequenza di taglio dell’enzima di restrizione
EcoRI
AFLP – fasi sperimentali
lDigestione
del DNA con enzimi di
restrizione
lLegame
di oligonucleotidi adattatori alle estremità dei
frammenti (permettono l’attacco dei primer nella fase
successiva)
lPreamplificazione
tramite PCR di parte dei
frammenti generati
lAmplificazione
selettiva e contemporanea
marcatura di parte dei frammenti
preamplificati
lVisualizzazione
tramite elettroforesi dei
frammenti selezionati e marcati
TaqI
AFLP
Marcatore
polimorfico
Marcatore
monomorfico
Applicazioni dei marcatori nel settore
zootecnico
•Costruzione di mappe genetiche e fisiche
•Mappatura di geni utili
•Isolamento di geni utili
•Mappatura di QTL
•Diagnosi di anomalie genetiche
•Analisi di paternità
•Studi su filogenesi, variabilità genetica,
struttura e dinamica di specie e popolazioni
•Stima della consanguineità e ausilio ai piani
di accoppiamento
•Tracciabilità dei prodotti
QTL: QUANTITATIVE TRAIT LOCUS
sequenza
genomica
che
ha
un
ruolo
nell’espressione di un carattere quantitativo
è associata alla manifestazione di un carattere
produttivo; probabilmente contiene un gene che
è coinvolto nell’espressione di quel carattere
se si individua un marcatore ad essa
contiguo/associato si può selezionare per il
carattere desiderato (es. produzione di latte)
semplicemente valutando la presenza/assenza di
determinate varianti alleliche del marcatore
Mappa genetica
..e identificazione di QTL
SELEZIONE ASSISTITA DA
MARCATORI
l’identificazione di
un’associazione tra marcatore
e QTL permette una selezione
più efficiente
CLONAGGIO DI POSIZIONE
identificare e clonare un gene
che influenza un carattere
quantitativo
Analisi paternità con microsatelliti
Due alleli del microsatellite
PADRE
GENOTIPO: 263/263
GENOTIPO: 128/140
PADRE
128
263
GENOTIPO: 128/146
GENOTIPO: 263/277
MADRE
MADRE
128
263
146
277
FIGLIO
263
GENOTIPO: 128/128
128
GENOTIPO: 263/263
FIGLIO
140
FIGLIO
GENOTIPO: 124/128
124
128
GENOTIPO: 263/277
FIGLIO
263
277
FIGLIO
GENOTIPO: 128/128
128
DIAGNOSI POSITIVA
DIAGNOSI NEGATIVA
Analisi di paternità
Paternità:
• esclusa in modo deterministico
- il figlio ha un allele diverso da quello dei
genitori
- il figlio non ha almeno un allele di
ciascun genitore
• provata solo in modo probabilistico
APPLICAZIONI
•Stime degli indici genetici con il metodo
BLUP-Animal Model
•Piani di accoppiamento
•Calcolo dell’ereditabilità
Marcatori e tracciabilità
Utilizzando contemporanemente più
marcatori si ottengono profili allelici in
grado di identificare in modo univoco
gli individui
impronte digitali del DNA (fingerprinting)
Se il profilo dell’individuo è unico o è altamente
probabile che lo sia, posso riconoscere l’individuo
stesso a partire da campioni di tessuto (sangue, pelo,
carne, latte) dai quali ottengo il DNA da sottoporre
all’analisi dei marcatori
TRACCIABILITÀ
In corrispondenza di ogni marcatore ogni individuo avrà uno
solo (omozigosi) o due degli alleli possibili
la probabilità che due individui abbiano
combinazione di alleli in un locus può essere alta
la
stessa
se aumentiamo il numero dei marcatori la probabilità che due
individui presentino la stessa combinazione di alleli per tutti i
loci diventa piccolissima
Numero loci
(marcatori)
Probabilità di
matching (stesso
profilo) *
1
12.50000000 %
2
1.56250000 %
3
0.19531250 %
4
0.02441406 %
5
0.00305176 %
10
0.00000005 %
*considerando che tutti gli alleli in tutti i loci abbiano una frequenza pari a 0.25
(quattro alleli per ogni locus)
Marcatori
e variabilità genetica
BIODIVERSITA’:
“...the variability among living organism in all
the ecosystems in which they are part …”
(FAO 1992)
Misurare la diversità
a) a livello fenotipico:
- caratteri morfometrici
- caratteri morfologici
•Una porzione molto elevata di diversità
genetica non è espressa
•Nuove tecnologie permettono di rivelarla
b) a livello genotipico:
- marcatori biochimici
- marcatori molecolari
Marcatori molecolari
La variabilità è espressa da:
•
Numero e % di marcatori polimorfici
•
Numero medio di alleli per locus
La variabilità è quantificabile tramite:
Eterozigosi attesa
Hexp=1-p2- q2
•Calcolo delle distanze genetiche
•
Rappresentazione delle
distanze attraverso un
dendrogramma
Marcatori molecolari e distanze
genetiche
Individuo A
Individuo B
Confronto profili ottenuti
con analisi marcatori
Stima della diversità in
termini di numero di bande
comuni e bande non
condivise
Maggiori le differenze fra i
profili ⇒
Maggiori le diversità a livello
genomico
Importanza della conservazione della
biodiversità nelle specie zootecniche
ü Soddisfare future richieste di mercato
ü Soddisfare futuri bisogni dell’uomo
ü Affrontare nuove patologie e condizioni ambientali
ü Valore storico e culturale
ü Valore ecologico (equilibrio ecosistema)
ü Conservazione del territorio
ü Valore socio-economico in aree marginali e PVS (es.
prodotti tipici, turismo)
