Nucleotidi e coenzimi Basi azotate • Le basi azotate coinvolte nella formazione di nucleotidi e coenzimi appartengono a due famiglie principali: 6 – Purine 5 N1 N 7 3 2 8 9 N 4 N H 4 – Pirimidine N 2 5 3 1 N 6 -2- Purine • Le basi puriniche sono: NH2 6 Adenina - A N N 6-amminopurina N N H OH 6 Guanina - G 6-idrossi-2-aminopurina H 2N N 2 N N N H -3- Purine • La struttura delle basi puriniche è legata alla tautomeria cheto-enolica: H H3C O H3C CH3 CH3 H3C H O CH3 Guanina - G OH N N H2N N O O N H N HN H2N N N H N HN HN N H N H -4- Pirimidine • Le basi pirimidiniche sono: Timina - T 2,4-diidrossi-5-metilpirimidina O CH3 HN O N H NH2 Citosina – C 2-idrossi-4-metilpirimidina N O N H O Uracile - U 2,4-diidrossipirimidina HN O N H -5- Pirimidine • Anche la struttura delle basi puriniche è legata alla tautomeria cheto-enolica: H Timina (Uracile) H3C O H3C CH3 CH3 OH HO CH3 O O CH3 N H H3C O CH3 HN HO N O N N N HO N H NH2 NH2 Citosina CH3 HN N O N H -6- Solubilità • Le basi azotate sono insolubili in acqua, la loro solubilità è aumentata dal legame con molecole molto idrosolubili: O • ribosio OH HO OH HO O • 2-deossiribosio CH2OH HO HO O OH CH2OH OH O OH OH OH OH -7- Ribosio e 2-deossiribosio -ribosio CH2OH O OH OH OH 2-deossi--ribosio CH2OH O OH OH -8- Nucleosidi • Il legame si forma tra il C1 dello zucchero e con l’atomo di azoto non coinvolto nella tautomeria. • Si formano i nucleosidi, in questo caso l’adenosina. NH2 N N N N N N 5' NH2 H CH2OH OH O N N 3' OH N O O HO NH2 N CH2OH 1' 4' OH OH N N 2' OH OH OH -9- Nucleotidi • La funzione alcolica primaria rimasta libera può essere esterificata con l’acido fosforico (fosfoestere), per esempio con l’adenosina, si ottiene una molecola idrosolubile e carica. Adenosinmonofosfato (AMP) NH2 N N P O O HO O 4' P O 5' O O N N O N N O NH2 N O 5' O 1' 3' OH 2' OH N 1' 3' OH OH - 10 - Nucleotidi • Più in generale: O P O O BASE AZOTATA O BASE AZOTATA --O3PO 5' O O 1' 1' 3' 3' OH 5' OH OH OH - 11 - Deossinucleotidi • Più in generale: O P O O BASE AZOTATA O BASE AZOTATA --O3PO 5' O 5' O 1' 3' 3' OH OH 1' - 12 - Nucleotidi ciclici • Anche la funzione alcolica in 3’ può essere esterificata con una funzione acida libera dello stesso acido fosforico, si ottengono i nucleotidi ciclici: cAMP NH2 N N N O O P O 5' N O 3' O OH - 13 - Nucleotidi e acidi nucleici • Il legame può anche avvenire tra nucleotidi diversi attraverso esterificazioni in 3’ e 5’ per formare catene polinucleotidiche (acidi nucleici). NH NH 2 Nucleotide O P N O 5' O O O O P P O O N O NH2 O P O O N O 3' OH P N O 3' O N N N O O O N O N N 5' NH2 OH N O N N N N 2 Deossinucleotide N Nucleotide O Acido ribonucleico (RNA) O O P Deossinucleotide O Acido deossiribonucleico (DNA) - 14 - Nucleotidi e acidi nucleici RNA DNA - 15 - Nucleotidi liberi O P O • I monofosfonucleotidi hanno la possibilità di essere ulteriormente fosforilati per formare i difosfonucleotidi (ADP) e i trifosfonucleotidi (ATP) NH2 O O P O N N N N O O 5' O 1' 3' OH OH NH2 O P O O O O P O O O P O N N N N O 5' O 1' 3' OH OH - 16 - Nucleotidi liberi • I monofosfonucleotidi hanno la possibilità di essere ulteriormente fosforilati per formare i difosfonucleotidi (ADP) e i trifosfonucleotidi (ATP) - 17 - Nucleotidi liberi • I legami che tengono insieme i residui di fosfato sono legami di tipo anidridico. NH2 O P O O O P O N N N N O O 5 O 1 3 OH O O O P P O OH O + 3H2O O 2 P O OH + 4 H+ O - 18 - ADP e ATP • Legami di tipo anidridico • Legami di tipo fosfoestereo NH2 O P O O O N N O N P NH2 N O O O O OH ADP O O P P O O O O P O O OH N N N N O O OH OH ATP - 19 - A cosa servono i nucleotidi • Trasporto di energia – ATP (GTP), ADP, AMP, • Segnali intracellulari – cAMP • Trasporto di equivalenti ridotti – NAD+/NADH, NADP+/NADPH – FAD/FADH2 • Trasporto di acili – CoA • … - 20 - - 21 - Trasporto di energia O • ATP O P O O O O P P O O O O N O HO O • ADP N N OH O P O NH2 N O P O O O N O HO NH2 N N N OH O • AMP O P O O HO • GTP O O P O O O P O N O NH2 N OH N N O O P O N O O HO O N OH N NH NH2 - 22 - Trasporto di energia ATP + H2O ADP + PO43G°’ = -7.3 kcal·mole-1 (-30.6 kJ·mole-1) a pH 7 G° = -10 kcal·mole-1 (-42 kJ·mole-1) a pH 9 O P O H .. O O O O P O O P O O O HO H O O O P O O + O N O NH2 N OH N N O P P O O O O N O HO NH2 N OH N N - 23 - G°’ • Il valore di G°’ dipende da: – Forza ionica – Concentrazione di Mg++ – Concentazione di Ca++ • Nelle normali condiziono cellulari vale circa: -12 kcal·mole-1 • I nucleotidi sono contemporaneamente: – – – – Stabili Solubili Carichi Reattivi - 24 - G°’ • Altre molecole fosforilate hanno G°’ negativo O O H .. O P O H O O P O O O O P O N O O HO NH2 N N N OH O O P O + O P O O O O P O O N O HO NH2 N OH N N G°’ = -7.3 kcal·mole-1 O O H H HO H HO H H H HO OH G°’ = -3.3 kcal·mole-1 P O H .. O OH H H O O H HO OH H O OH O + O P O O OH H - 25 - Perché il G°’ dell’ATP vale –7.3 kcal·mole-1? • Repulsione tra cariche – Maggiore in ATP che in ADP O O O O P P P O O O O O O P P O N O HO O HO N N OH N O O NH2 N O O O O NH2 N OH N N - 26 - Perché il G°’ dell’ATP vale –7.3 kcal·mole-1? • Stabilizzazione per risonanza – Del fosfato O O P O 3-, H+ O O O P O O O = O O O P O O O P O 3-, H+ O P O O O - 27 - Trasporto di energia ATP + H2O AMP + P2O74- 2PO43G0’ = -7.3 kcal·mole-1 G0’ = -8 kcal·mole-1 O O O O P P P O O H O .. O O O O O HO H N NH2 N OH N N O P O O O N O HO NH2 N OH N N O + O P O O O O P O O 2 O P O O - 28 - ATP e Mg++ • Nella cellula l’ATP è spesso complessato con lo ione Mg++ O O O O P P P O O O O Mg++ O N O O HO NH2 N OH N N • Per formare un complesso ibridizzato … - 29 - Altre molecole “energetiche” • Hanno G0’ negativo nella reazione di idrolisi del gruppo fosfato. G°’= -14.8 kcal·mole-1 G°’= -10.3 kcal·mole-1 O O P O H3C O O H H O Fosfoenolpiruvato O G°’= -10.3 kcal·mole-1 O H N O P O P O Acetilfosfato O O O NH2 + N H O O Fosfocreatina - 30 - Come si fa a “ricaricare” l’ADP per formare ATP • Attraverso la catalisi di un enzima (piruvato chinasi) ADP PEP O O P O O O + P O O O O P O O N O O H H HO O O O O O P P O NH2 N OH piruvato chinasi N N O P O O O O O HO ATP NH2 N OH N O OH N N + O H H EP O O H H H O Piruvato - 31 - Reazioni accoppiate • L’idrolisi del fosfato permette, attraverso l’accoppiamento, ad altre reazioni NON SPONTANEE di avvenire ugualmente. • L’ATP viene in genere usato dalla cellula come trasportatore di fosfati e come donatore di energia (sottoforma di G). • Per produrre ATP un modo consiste nell’accoppiarne la sintesi (da ADP e Pi) all’idrolisi di molecole con G di idrolisi maggiore (in valore assoluto). • Tutto ciò avviene attraverso… - 32 - …gli ENZIMI - 33 - Enzimi • Permettono l’accoppiamento di reazioni chimiche: –Nello stesso posto –Nello stesso momento - 34 - Reazioni accoppiate • Consideriamo l’equilibrio A Keq = B [B]eq [A]eq = 10 - G°' = 4 kcal mole-1 G°' RT = 1.15 10-3 (a 25°C) • Se la reazione è accoppiata all’idrolisi di ATP attraverso un enzima: A + ATP + H2O Keq = B + ADP + Pi + H+ [B]eq [ADP]eq [Pi]eq [B]eq [A]eq [A]eq [ATP]eq = [ATP]eq [ADP]eq [Pi]eq G°' = -3.3 kcal mole-1 = 2.67 102 Keq - 35 - Reazioni accoppiate • Nella cellula il rapporto: [ATP] [ADP] [Pi] [B]eq [A]eq ~ 500 = 2.67 102 x 500 = 1.34 105 1.34 105 ~108 1.15 10-3 • In presenza di idrolisi di ATP la Keq di una reazione può aumentare di 108 volte; • Se l’idrolisi di una mole di ATP (-7.3 kcal) non bastano più moli di ATP possono essere impiegate. - 36 - Reazioni accoppiate AeB • Non sono necessariamente due composti chimici ma possono essere: – differenti conformazioni di una molecola; – differenti concentrazioni di uno ione ai lati di una membrana, – ecc… – … stati iniziali e finali di una TRASFORMAZIONE! - 37 - Trasporto di elettroni NAD+ nicotinamide adenindinucleotide Acido nicotinico O O OH NH2 N Nicotinamide N O H NH2 O + N O O HO O P O O P O O N O OH HO Nicotinamide NH2 N OH N N Adenina Dinucleotide - 38 - Trasporto di elettroni Come funziona il NAD+ O H NH2 + N Stato ossidato O O HO O O P P O O NAD+ O O HO H H N O OH NH2 N N N OH + H+ + 2e(H-) O NH2 Stato ridotto N O O O HO O P O O P +H+ NADH O O N O OH HO NH2 N OH N N - 39 - Trasporto di elettroni Come funziona il NAD+ Stato ossidato Stato ridotto - 40 - Trasporto di elettroni H O H NH2 + N + H+ + NAD+ O NH2 2e- (H-) R H N R NADH • Trasporta DUE elettroni per molecola • Reazione catalizzata dalle DEIDROGENASI - 41 - Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12) H come H H 3-fosfogliceraldeide GAP H Intermedio tioacetalico NAD+ G°' = +6.3 kJ mol-1 S O R O 2 OH CH2 OPO3-- B 3 + NADH NAD+ HPO4-NAD+ H Complesso H S H O Enzima-substrato O Intermedio aciltioestere R S R H B NAD H H+ --O3 P O H O 4 1 + NADH GAP NAD+ NAD+ OH CH2 OPO3-- 1,3-bifosfoglicerato 1,3BPG B S O NAD+ 5 O O S H P O OH R B PO3-O O + H+ H B + R 1,3BPG - 42 - Gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (EC 1.2.1.12) NAD+ Cys carbossimetilata - 43 - Trasporto di elettroni NADP+ nicotinamide adenindinucleotide fosfato H O NH2 O + N O O HO O P O O P O O N O OH HO NH2 N N O O P N O O Adenina Fosfato Nicotinamide Dinucleotide - 44 - Trasporto di elettroni FAD (flavinadenindinucleotide) (Forma ossidata) O H3C N H3C N Base di Shiff ridotta Ribosio in forma aperta NH N H H HO O H H OH H HO O O O P O O P O O N O HO NH2 N OH N N - 45 - Trasporto di elettroni FAD (flavinadenindinucleotide) (Forma ossidata) O H3C N H3C N Base di Shiff ridotta Ribosio in forma aperta NH N H H HO O H H OH H HO O O O P O O P O O N O HO NH2 N OH N N - 46 - Trasporto di elettroni Come funziona il FAD O H3C H3C N N H H NH N R FAD (ossidato) O + H R H3C N NH R' H3C H O N H N H O H R' R H + R FADHz (ridotto) - 47 - Trasporto di elettroni Il FAD è legato alle proteine, (in questo caso la alcolvanillilico ossidasi) - 48 - Trasporto di acili • Gli acili e • gli acetili O R H3C O • Vengono trasportati dal coenzima A (CoA) acido pantotenico HS H H N N O ADP O H OH O O H3C CH3 P O O O P O O N O -mercaptoetilamina HO NH2 N OH N N - 49 - Trasporto di acili • Attraverso la formazione di un legame tioestere R O S H H N N O Legame tioestere O H OH O O H3C CH3 P O O O P O O N O HO NH2 N OH N N - 50 - Proteina acil-CoA • Complesso tra la proteina legante acil-CoA, Coa e palmitoile - 51 - Coenzimi • Molecole non proteiche legate che permetto a proteine di svolgere attività enzimatiche: – – – – – – – – – Tiamina (Vit. B1) Tiamina pirofosfato Riboflavina (Vit. B2) FAD e FMN Acido Nicotinico (niacina) NAD+ e NADP+ Piridossina, piridossale, piridossamina (Vit. B6) Piridossalfosfato Acido pantotenico Coenzima A Biotina legata alla carbossilasi Acido folico Tetraidrofolato Cobalamina (Vit. B12) coenzimi a cobamide Acido ascorbico antiossidante - 52 - Tiamina + N N H3C N H3C OH NH2 CH 3 + N N N S O O S NH2 CH 3 P P O O O O O - 53 - Piridossina, piridossale, piridossamina Piridossalfosfato H OH H OH HO + N H H O H OH HO + N CH3 H CH3 H O O P H NH2 OH HO + N CH3 H O O OH O + N CH3 H - 54 - Piridossina, piridossale, piridossamina Piridossalfosfato - 55 - Biotina OH S O CH3 H3C NH HN O - 56 - Acido folico e acido tetraidrofolico O N N H 2N N N H H 2N N N H H O O OH OH N H N N OH H N O O OH N O H O N H H O H H H - 57 - Cobalamina H2N O NH2 O H3C H 2N N H H3C N H2N O N 3+ H Co HN R CH3 CH3 CH3 CH3 O NH2 O CH3 H3C O HO HO N NH2 N OH N N CH3 CN- HN O H3C HO O P H2N HN O O OH N O CH3 CH3 O HO - 58 - Acido ascorbico OH O H HO OH H O - 59 -