Diapositiva 1 - Policlinico di Modena

Aggiornamenti in tema di Genetica Medica
Dr. Antonio Percesepe
Genetica Medica
Dipartimento Sc. Mediche e Chirurgiche
Università di Modena
Outline
• Definizione dell’attività di un Servizio Clinico di
Genetica Medica
• Esempi di consulenze genetiche in epoca
prenatale
• Luci ed ombre delle nuove tecnologie
diagnostiche nei fenotipi complessi
Genetica medica
Definizioni
1. La scienza delle variabilità biologica umana per quanto riguarda il
suo rapporto con la salute e la malattia
2. Lo studio dell’eziologia, patogenesi e storia naturale delle malattie a
base genetica
3. L’applicazione della genetica alla medicina o alla pratica medica
Da: Emery and Rimoins: Principles and practice of Medical Genetics
Servizi di Genetica Medica:
“Servizi integrati clinici e di laboratorio forniti a soggetti e familiari
affetti o a rischio di malattie con una significativa componente
genetica, comprendendo in tale definizione malattie genetiche
sia ereditarie che sporadiche.
I principi della malattia: le basi genetiche
• Perché ammaliamo?
• Perché questa
malattia?
• Perché proprio io?
• Perché proprio adesso?
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale
delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnosticoterapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio
specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e
fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire
servizi per i pazienti con malattie a base genetica
Sindrome di Marfan (OMIM 154700)
•
•
•
•
Manifestazioni scheletriche
– alta statura
– arti lunghi e sottili
– aracnodattilia
– scoliosi
– torace escavato o a carena
Manifestazioni oculari
– ectopia lentis (80% degli affetti da MFS)
Manifestazioni cardiovascolari
– Insufficienza aortica
– dilatazione dell’aorta ascendente con
possibilità di complicazione nella
dissecazione
Altri apparati (polmoni, meningi, etc.)
Analisi di mutazione nel gene FBN1
Gene di 230 Kb, costituito da 65 esoni che codificano per la
proteina di struttura fibrillina
Nei primi studi (SSCP o su cDNA) il tasso di mutazioni
era tra il 9 ed il 23%. Oggi i tassi di mutazione oscillano
tra il 57 ed il 90%
Criteri di Ghent: diagnosi di certezza se combinazione di
criteri maggiori in due organi ed il coinvolgimento di un
terzo organo
Ghent +
66%
Ghent 5%
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
(a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia
naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale
diagnostico-terapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di
laboratorio specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche
e fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel
fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica
Retinite pigmentosa
•
•
•
•
•
Geneticamente eterogenea: forme
autosomiche dominanti, autosomiche
recessive, X-linked recessive, mitocondriali
Isolata o sindromica?
Sporadica o familiare?
L'analisi ha evidenziato la mutazione c.2200G>A, p.Gly734Arg in
omozigosi nel gene CRB1 (CRUMBS, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 1
MIM *604210). Tale mutazione non è stata mai descritta in letteratura
come associata a retinite pigmentosa ma essa può esser considerata
patogenetica perchè riscontrata in omozigosi anche nei due figli affetti
(pseudominanza, essendo il marito, non affetto, consanguineo della
paziente e quindi verosimilmente portatore della stessa mutazione genica).
Non vi sono altre mutazioni nei geni analizzati.
Mutazioni bialleliche di CRB1 sono responsabili di un fenotipo retinico che
va da distrofie dei coni e bastoncelli ad esordio in epoca infantile o
giovanile a casi classici di retinite pigmentosa. La gravità dei casi descritti
è piuttosto variabile anche se in generale l'esordio tende ad esser precoce
e l'andamento progressivo. In ogni caso non vi è in letteratura una
correlazione tra le mutazioni descritte in CRB1 ed il fenotipo dei pazienti.
RETINITE PIGMENTOSA
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
(a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale
delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnosticoterapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio
specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e
fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire
servizi per i pazienti con malattie a base genetica
Neurofibromatosi tipo I
• Prevalenza della malattia:
1:2500/1:5000
• Alto tasso di prime mutazioni (30-50%
dei casi non ha un genitore affetto): 10-4
per allele per generazione (nella
maggior parte dei casi a carico dell’allele
paterno)
Noduli di Lisch
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia
naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale
diagnostico-terapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di
laboratorio specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche
e fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel
fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica
Pannello geni distrofie retiniche
GENE
DISEASE
ABCA4
RP19/Stargardt1
# EXON
CHROMOSOME
48
1p
1:10000 prevalence
GENE
BEST1
RP50
6
11q
CA4
RP17
8
17q
CRX
RP
4
19q
ELOVL
4
Starga
rdt3
6
6q
FSCN2
RP30
5
17q
GUCA
1B
RP48
4
6p
3% adRP
IMPD
H1
RP10;
LCA11
17
7q
2% adRP
KLHL7
RP42
14
7p
1-2%
adRP
1-3% LCA
NRL2
E3
RP37
8
15q
1p
10%RP in Israel
NRL
RP27
3
14q
35
6q
10-20%arRP
OTX2
LCA
4
14q
RP28
7
2p
PRPF3
RP18
16
1q
GUCY2D
LCA1
20
17p
PRPF6
RP60
21
20q
IDH3B
RP46
11
20p
PRPF8
RP13
43
17p
IMPG2
RP56
19
3q
IQCB1
LCA
15
3q
PRPF3
1
RP11
14
19q
2.5% adRP
KCNJ13
LCA16
3
2q
PRPH
2
RP7
3
6p
5% adRP
LCA5
LCA5
9
6q
LRAT
RP; LCA14
3
4q
RDH1
2
RP
9
14q
MAK
RP62
14
6p24
RHO
RP4
5
3q
MERTK
RP38
19
2q
NMNAT1
LCA9
5
ROM1
RP7di
genic
3
11q
NR2E3
RP
ORP1
RP1
4
8q
NRL
RP
PAP1
RP9
6
7p
AILP1
5-10% LCA
LCA4
6
17p
C2ORF71
RP54
2
2p
C8ORF37
RP64; CRD16
6
8q22
CABP4
LCA
6
11q
CEP290
LCA10
52
12q
CERKL
RP26
12
2q
CLRN1
RP61
5
3q
CNGA1
RP49
10
4p
2.3%arRP
CNGB1
RP45
31
16q
rare
CNGB3
Stargardt
18
8q
CRB1
RP12; LCA8
12
1q
CRX
LCA7
DHDDS
RP59
9
EYS
RP25
FAM161A
BEST1
1p36.22
20% LCA
9-13% LCA
20% arLCA; 40%adCRD6
#
EXON
CHRO
MOSO
ME
DISEA
SE
IMPACT
1-3% LCA
10%RP;
28% adRP
510%adRP
• L'analisi ha evidenziato la presenza della mutazione c.785C>G
(p.Ala262Gly) nel gene RPGR ("RETINITIS PIGMENTOSA
GTPase REGULATOR; MIM*312610), localizzato sul
cromosoma X e responsabile, quando mutato, della forma
legata all'X di retinite pigmentosa. Non sono state riscontrate
variazioni significative in alcuno degli altri geni studiati.
• La mutazione non è mai stata riportata in pazienti affetti da
retinite pigmentosa (fonte: database Retina International), ma
viene valutata come patogenetica dai softwares di predizione
informatica e può esser considerata causativa della malattia.
Anche la trasmissione madre-figlio della retinite pigmentosa
malattia è compatibile con la localizzazione del gene sul
cromosoma X, in quanto per il gene RPGR sono state descritte
molte donne eterozigoti per la mutazione di RPGR affette da
forme con età di insorgenza e gravità del tutto indistinguibili da
quelle del sesso maschile.
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
(a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia
naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale
diagnostico-terapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di
laboratorio specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche
e fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel
fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica
Valutazione clinica della
malformazione
Diagnosi di accettazione:
Lesione da briglie amniotiche
Eziopatogenesi delle malformazioni congenite dell’arto
superiore
35%
31%
24%
6 %
4%
vascolare
complessa
monogenica
cromosomica
da teratogeni
PROGNOSI GENETICA: RISCHIO DI RICORRENZA PARI A
QUELLO DELLA POPOLAZIONE GENERALE
Valutazione clinica e radiologica dei genitori
Sindattilia 4-5° dito della mano
Le brachidattilie isolate: classificazione
Difetti di penetranza ed espressivita’ variabile
Le brachidattilie
Le brachidattilie isolate: classificazione
Cosa fa il genetista clinico
Il genetista clinico deve essere in grado di:
(a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica
b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia
naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale
diagnostico-terapeutico dei pazienti
c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari
d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di
laboratorio specializzati
e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche
e fornire una stima del rischio genetico
f) interagire con altri professionisti del campo della salute
nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base
genetica
Ruolo del genetista medico nell’iter diagnosticoterapeutico delle malattie in epoca pediatrica
• Negli iter diagnostici che prevedono la presenza del
dismorfologo, il genetista si pone come interfaccia tra
questo e la famiglia
• Conferma la diagnosi posta o ne formula una diversa,
aiutato anche dalle informazioni genetiche
• Nei casi ove non si conosca il gene formula prognosi
genetiche per la predizione dei rischi e delle
caratteristiche di ricorrenza
• Nei casi ove si conosce il gene organizza la diagnosi
genomica avvalendosi dei laboratori regionali, nazionali,
internazionali che li eseguono
• In entrambi i casi conclude con una consulenza scritta
Distribuzione territoriale centri di Genetica Medica e rapporto con la popolazione
Area
Northern
Central
Southern
Islander
Total Italy
Region
Living
population
Medical genetic centres
Population/no. centres ratio
Emilia Romagna
4 151 369
20
207.568
Friuli
1 204 718
7
172.103
Liguria
1 592 309
11
144.755
Lombardia
9 393 092
42
223.645
Piemonte
4 330 172
14
309.298
Trentino Alto Adige
974 613
3
324.871
Valle D'Aosta
122 868
1
122.868
Veneto
4 699 950
27
174.072
Lazio
5 269 972
27
195.184
Marche
1 518 780
3
506.260
Toscana
3 598 269
16
224.892
Umbria
858 938
5
171.788
Abruzzo
1 299 272
3
433.091
Basilicata
596 546
3
198.849
Calabria
2 009 268
5
401.854
Campania
5 788 986
22
263.136
Molise
321 953
2
160.977
Puglia
4 068 167
18
226.009
Sardegna
1 650 052
6
275.009
Sicilia
5 013 081
21
238.718
58 462 375
256
228.369
Test genetici
Analisi di specifici geni, del loro
prodotto o della loro funzione, nonché ogni
altro tipo di indagine del DNA o dei
cromosomi, finalizzate ad individuare o ad
escludere modificazioni del genoma,
verosimilmente associate a patologia
umana
Test diagnostici (o sintomatici)
Sono finalizzati a stabilire o a confermare una
diagnosi clinica o un quadro patologico sospettato,
ma non definitivamente inquadrato dalla obiettività
clinica.
Alcuni di questi test vengono utilizzati per
identificare gli eterozigoti (o portatori sani) per
mutazioni comuni, i quali presentano un aumento
del rischio riproduttivo qualora anche i propri
partner siano eterozigoti per lo stesso gene mutato
Test presintomatici o preclinici
Identificano mutazioni che inevitabilmente
portano alla comparsa di una malattia
prima del suo esordio clinicamente
evidenziabile. Per definizione, sono
presintomatici i test applicati nella
diagnosi prenatale e quelli che, all’interno
delle famiglie a rischio, identificano i
portatori di geni associati a malattie ad
esordio tardivo
CONSENSO INFORMATO PER L’ESECUZIONE DI ANALISI GENETICHE
Il sottoscritto/a ___________________________________________________________________
Nato/a __________________________________________ (Prov_________) il________________
Residente in__________________________________ (Prov_________) CAP _________________
Via_____________________________________N°______ Tel _____________________________
DICHIARA
di aver ricevuto informazioni riguardo gli aspetti genetici della malattia presente nella famiglia e/o da cui è affetto e di aver
compreso l’utilità dell’analisi genetica proposta e dei suoi eventuali limiti.
ACCONSENTE quindi al prelievo a cui si sta sottoponendo per l’analisi:
________________________________________________________________________________________________
DICHIARA inoltre di
 Volere  NON volere
essere informato circa i risultati dell’analisi
 Volere  NON volere
contattare altri membri della famiglia il cui coinvolgimento potrebbe essere rilevan
te ai fini delle analisi genetiche
 Volere  NON volere
che il DNA estratto possa essere utilizzato in futuro per ulteriori indagini a fini dia
gnostici
 Volere  NON volere
che il DNA estratto possa essere eventualmente utilizzato in forma anonima per
studi di interesse genetico
 Volere  NON volere
autorizzare l’acquisizione di fotografie che documentano il caso
 Volere  NON volere
autorizzare l’impiego e la pubblicazione dei dati, anche fotografici, in forma anonima,
per sco
pi scientifici
Il personale sanitario che ha accesso ai dati personali si attiene alle norme della Legge sulla privacy:
Decreto legislativo 30 giugno 2003 n. 196 - Codice in materia di protezione dei dati personali
Il sottoscritto/a si impegna a comunicare tempestivamente ogni eventuale cambiamento di opinione in merito a quanto
dichiarato.
Data_________________________
Firma __________________________________
Il Genetista che ha raccolto il Consenso informato _______________________________________
Consulenza genetica prenatale
• Richiesta principalmente a scopo prognostico
• Rapidità nell’accesso
• Prognosi chiaramente comprensibile di malattie scarsamente
conosciute
• Non direttività
• Uso limitato di accertamenti per i limiti temporali dell’IVG
• Correlazione genotipo/fenotipo difficile
• Scarse possibilità di anticipare le conseguenze della malattia in
termini di gravità e controlli da eseguire a fronte di una necessità di
scelta in termini di gravità della patologia
Women who receive a prenatal diagnosis of a
chromosome abnormality remember the
circumstances precisely. Years later they
recall the exact words used to deliver the news, and
many regret the manner in which they were told. They
read between the lines messages that their fetus is no
longer worthy of life and that their feelings about the
pregnancy are not important. A test result showing
that a fetus has a chromosomal difference leaves
women and their partners with a permanent and life
altering decision whether or not to continue the preg
nancy.
Discondrosteosi di Leri-Weill
1
2
I
1
2
3
II
S
H
O
X
0.5 1 1.5
0.5 1 1.5
0.5 1 1.5
0.5 1 1.5
0.5 1 1.5
I:1
I:2
II:1
II:2
II:3
1
5
10
15
ENH
IL3RA
ASMT
C
O
N
T
R
O
L
20
25
30
35
40
45
Onfalocele ricorrente
S. di Beckwith-Wiedemann
CLINICA
– Iperaccrescimento prenatale
– Macroglossia
– Onfalocele
– Visceromegalia
– Emi-ipertrofia
– Aumentata suscettibilità ai
tumori infantili, in particolare
tumore di Wilms
s. di Beckwith Wiedmann familiare
Curve di crescita prenatali
I disordini genomici
• Le s. da microdelezione/duplicazione appartengono ai
disordini genomici, termine che indica una sindrome
costituzionale, spesso con ritardo mentale ed anomalie
multiple del fenotipo, causata da riarrangiamenti
strutturali di particolari regioni cromosomiche
• Tali riarrangiamenti sono un evento non casuale, in
quanto mediato dalla presenza di sequenze di DNA
ripetitivo, note come dupliconi, o regioni LCR (Low Copy
Repeats), blocchi di poche sequenze ripetute con
elevata omologia reciproca (94-99%)
• Tali sequenze rappresentano circa il 10% dell’intero
genoma, ma sono localizzate in siti specifici
Ideogramma con le principali localizzazioni di delezioni e duplicazioni cromosomiche
Overview delle localizzazioni di tutte le microdelezioni/duplicazioni riportate sul database
DECIPHER
Riscontro occasionale di microdelezione 15q13.3
•
•
•
•
•
•
Giunge in consulenza per una valutazione prognostica di un riarrangiamento
genomico riscontrato su prelievo di villi coriali eseguito in data …..: nella fattispecie,
l'analisi dei riarrangiamenti genomici mediante array CGH, eseguito per scelta
materna, ha evidenziato la presenza di una microdelezione di 537 Kb a carico del
braccio lungo del cromosoma 15 (regione 15q13.3), coinvolgente il gene CHRNA7.
Tale delezione, dopo verifica sui genitori, è risultata de novo. L’analisi cariotipica
diretta su villi coriali ha evidenziato un cariotipo maschile normale. L'esame colturale
è tuttora in corso. Ecograficamente non sono state riscontrate anomalie
Sulla base di tali dati si possono fare le seguenti considerazioni:
•
La microdelezione 15q13.3 riscontrata occasionalmente in corso di diagnosi
prenatale rappresenta una condizione di significativo rischio per l'insorgenza di
disturbi neuropsichiatrici, che comprendono la disabilità intellettiva, i disturbi dello
spettro autistico, la schizofrenia, i deficit attentivi ed i problemi comportamentali. La
penetranza totale di tale delezione si avvicina all'80%, anche se la microdelezione
riscontrata nella sig.ra .......i è atipica, ovvero più piccola della classica delezione
15q13.3, ma coinvolge la regione critica del gene CHRNA7. In tali situazioni, il rischio
di disturbi neuropsichatrici non differisce significativamente dalle forme classiche di
delezione. Non vi è aumentato rischio malformativo.
•
Anche se la delezione è frequentemente ereditata da genitori definiti come
normali, studi di larga scala su controlli normali adulti non hanno riscontrato tali
riarrangiamenti se non in percentuali bassissime (uno studio Islandese su più di
100.000 individui ha riscontrato la microdelezione 15q13.3 atipica soltanto nello
0,0078% dei casi), escludendone pertanto il ruolo di variante priva di significato
patogenetico.
In conclusione, sulla base delle conoscenze attuali, la prognosi genetica per la
gravidanza in atto è la seguente:
Elevato rischio di disturbi neuropsichiatrici (80%) in assenza di quadri ecografici
prenatali malformativi
Ruolo del genetista medico nell’iter diagnostico
prenatale complesso
• Negli iter diagnostici complessi, il genetista si pone come
interfaccia tra il ginecologo e la famiglia
• Integra la diagnosi posta aiutato anche dalle informazioni
genetiche
• Nei casi ove non si conosca il gene formula prognosi
genetiche per la predizione del rischio fetale e delle
caratteristiche di ricorrenza nelle future gravidanze
• Nei casi ove si conosce il gene organizza la diagnosi
genomica avvalendosi dei laboratori regionali, nazionali,
internazionali che li eseguono
• In tutti i casi conclude con una consulenza scritta non
direttiva
Next generation sequencing (NGS)
NGS: tipologia
esoma
Intero
genoma
Tipologia di analisi: analisi mutazionale
Mutation scanning (for individual or small sets of
genes).
• A typical example is the use of NGS platforms for
amplicon based re-sequencing of the BRCA1 and
BRCA2 genes that have been extensively characterized
previously, and for which testing usually encompasses
Sanger sequencing of the coding region (and flanking
intronic sequences) plus deletion/duplication analysis,
• The NGS test should have at least the same sensitivity
and specificity as the current diagnostic offer. Reporting
would basically not be different from earlier reporting on
BRCA1 and BRCA2 screening.
Situazione in Emilia Romagna
• Da parte di numerosi laboratori di
diagnostica genetica è in atto un travaso
dei test classicamente eseguiti mediante
sequenziamento tradizionale sec. Sanger
in NGS (es. BRCA1 e BRCA2), colmando
con il sequenziamento tradizionale le
regioni non adeguatamente indagate in
NGS
Tipologia di analisi: esoma
Exome sequencing shall actually be divided into 2 different
applications.
• One is about targeted analysis for known genes, and the
instructions are similar to the ones given for targeted mutation
screening, except that aspects of unsolicited findings, and thus of
informed consent, are to be dealt with more extensively.
• The other application is the use of the exome for the identification
of novel genetic defects. This largely remains in the realm of
research, especially if the genes in which mutations are identified,
have not been previously associated with the particular disease; i.e. it
is difficult to offer such a thorough analysis in diagnostics. An
exception to that view is the use of exome sequencing in trios (patient
and parents) for the identification of de novo defects.
Comparazione tra Targeted Resequencing e Targeted
Data Analysis.
•
•
Pannelli “pre-sequenziamento” (Targeted Resequencing): permettono
l’arricchimento di specifiche regioni genomiche prima del sequenziamento,
così da analizzare un certo numero di pazienti in contemporanea e
abbattere i costi. Appropriato nell’analisi di quelle patologie per le quali
mutazioni in geni già noti coprono la maggior parte dei casi
Pannelli “in silico” (Targeted Data Analysis): in questo caso si effettua un
WES e successivamente si vanno ad analizzare solo quei geni già noti per
essere associati alla patologia in esame. In questo caso è possibile
analizzare solo pochi campioni per corsa, a seconda del tipo di
strumentazione di cui si dispone, e i costi sono maggiori. Il vantaggio ovvio
di questo approccio è che l’aggiornamento non richiede nessuna modifica al
disegno e alla piattaforma di arricchimento e permette, senza ulteriori costi,
di analizzare “nuovi” geni malattia in pazienti già sequenziati. Inoltre, nel
momento in cui una rivalutazione clinica del paziente facesse emergere un
sospetto differente da quello iniziale, può essere sufficiente cambiare il
“target” dell’analisi.
Definizione di test diagnostico e test di ricerca
TEST DIAGNOSTICO
• Un test diagnostico è qualsiasi test usato per la diagnosi di una malattia. In
genetica questo significa che un individuo viene studiato per cercare
varianti probabilmente patogeneiche che possano spiegare il fenotipo o per
escluderle ed escludere contemporaneamente il rischio familiare
• Il test diagnostico può esser specifico (sequenza della mutazione famiiliare),
o generale (come nella ricerca di CNV nella disabilità intellettiva). I test
diagnostici vengono eseguiti presso laboratori specializzati sottoposti a
controlli di qualità ed accreditamento.
TEST DI RICERCA
• Un test di ricerca è sotteso da un’ipotesi che può esser vera o meno ed
avere un impatto clinico molto limitato sul paziente
• I risultati ottenuti da un test di ricerca devono esser confermati presso un
laboratorio accreditato prima di esser trasferiti al paziente ed al suo curante
•
Sia nei test diagnostici che di ricerca le varianti riscontrate nei soggetti
nromali e le varianti patogenetiche nei soggetti affetti dovrebbero esser
condivisa su database locali o internazionali (ne sono già presenti
numerosi)
Pannello distrofie retiniche (72 geni)
nell’ambito del Progetto RARER
GENE
DISEASE
ABCA4
RP19/Stargardt1
AILP1
# EXON
CHROMOSOME
48
1p
1:10000 prevalence
LCA4
6
17p
5-10% LCA
C2ORF71
RP54
2
2p
C8ORF37
RP64; CRD16
6
8q22
CABP4
LCA
6
11q
CEP290
LCA10
52
12q
CERKL
RP26
12
2q
CLRN1
RP61
5
3q
CNGA1
RP49
10
4p
2.3%arRP
CNGB1
RP45
31
16q
rare
CNGB3
Stargardt
18
8q
CRB1
RP12; LCA8
12
1q
CRX
LCA7
DHDDS
RP59
9
1p
10%RP in Israel
EYS
RP25
35
6q
10-20%arRP
FAM161A
RP28
7
2p
GUCY2D
LCA1
20
17p
IDH3B
RP46
11
20p
IMPG2
RP56
19
3q
IQCB1
LCA
15
3q
BEST1
20% LCA
9-13% LCA
1-3% LCA
20% arLCA; 40%adCRD6
Tipologia di analisi: Whole genome sequencing
• Whole genome sequencing (WGS) will certainly come
of age very soon. Laboratories that plan to offer WGS in
a diagnostic context will have to deal with additional
aspects, beyond the ones presented in the current
guidelines. Still, the basics of NGS diagnostics will apply,
including minimal technical achievements, diagnostic
utility and informed consent issues.
Quale tipo di NGS?
Per la scelta dell’approccio si tiene conto di diversi fattori:
• Costi: l’uso di pannelli genici è privilegiato per motivazioni economiche, ma
il divario di costi si è progressivamente assottigliato: oggi ill sequenziamento
di un esoma può essere infatti meno dispendioso del sequenziamento di un
pannello di geni
• Finalità: in generale, le tecniche NGS trovano applicazione nel caso di
– malattie ad alta eterogeneità genetica (targeted resequencing o esoma?)
– patologie genetiche su base mendeliana con gene non ancora identificato
(esoma o WES?).
•
•
•
Sensibilità: questa è funzione soprattutto del coverage delle sequenze
indagate, ovvero dal numero di “letture” (reads) dei singoli tratti di DNA
esaminati e dal grado di sovrapposizione tra queste.
Probabilità di ottenere Risultati Incidentali e Varianti di Significato
Incerto: dipendono dall’ampiezza della porzione di genoma analizzata e
interrogata. L’analisi basata su pannelli è difficilmente associata a IF, poiché
le sequenze analizzate sono per definizione implicate nella condizione
clinica presentata dal probando.
Archiviazione dei dati: quanto più ampia la porzione di genoma analizzata,
tanto maggiore è il volume di dati prodotti. E’ necessario quindi che siano
disponibili o accessibili adeguate piattaforme per l’archiviazione, soprattutto
per analisi che producono una grande quantità di dati, come WES e, ancor
più, WGS.
Raccomandazioni operative per i test NGS
•
•
•
•
•
La caratterizzazione fenotipica è fondamentale per la scelta della tecnica di
diagnosi molecolare (sequenziamento Sanger, Targeted resequencing, WES) e per la
successiva analisi delle varianti identificate.
Nel caso di fenotipi con bassa eterogeneità genetica, può essere opportuno
valutare l’analisi con metodiche molecolari convenzionali. In generale, è auspicabile
che l’analisi molecolare di geni molto grandi (numerosi esoni) sia trasferita su
piattaforme NGS per l’abbattimento dei costi e dei tempi di refertazione.
Nel caso di condizioni con elevata eterogeneità genetica nelle quali mutazioni in
un numero ridotto di geni sono responsabili della maggioranza dei casi (> del 50%) è
auspicabile l’uso di un targeted resequencing. Tale strategia è indicata anche in caso
di sospetto mosaicismo.
Nel caso di condizioni con eterogeneità genetica particolarmente marcata dove
è coinvolto un numero sempre crescente di geni, ma ognuno è responsabile di una
bassa percentuale di casi (per esempio paraparesi spastiche ereditarie, retiniti
pigmentose, etc.) è indicata l’esecuzione di un WES con analisi limitata al pannello di
geni responsabili (pannello “in silico”). In caso di negatività dell’analisi di un pannello
di geni, i dati esomici restano quindi a disposizione per le eventuali indagini
successive indirizzate alla ricerca di nuovi geni candidati o per l’analisi di geni
causativi identificati in un secondo tempo.
Infine in tutti i casi in cui non può essere formulata un’ipotesi diagnostica su
base clinica è preferibile l’analisi dell’intero esoma per l’individuazione del difetto
genetico responsabile, che può riguardare mutazioni/geni già noti (ambito
diagnostico) o nuovi geni candidati (ambito di ricerca). E’ auspicabile che tali indagini
siano eseguite in centri con comprovata esperienza nell’ambito dell’analisi di dati
esomici per garantire la più alta probabilità di successo, che al momento, secondo la
letteratura medica, si attesta attorno al 25%
Procedure
Consenso informato ed informativa al paziente ed al medico
E’ necessario informare su:
• la malattia che viene analizzata,
• il nome dei geni testati,
• la sensibilità e specificità
• se vi sono delle malattie non rilevanti al fenotipo clinico che
potrebbero esser causate da mutazioni nel gene testato (es. sordità
in alcuni geni della retinite pigmentosa)
• La pipeline di analisi dei laboratori diagnostici deve focalizzarsi ed
esser validata sul pannello genico oggetto dell’indagine per evitare
la possibilità di risultati incidentali
• I laboratori comunque dovranno informare sulla possibilità di risultati
incidentali
Consenso informato
Specificità dell’NGS in merito a risultati inattesi
Desidera 
Non desidera 
essere informato, se dovesse risultare portatore “sano” di patologie
genetiche con prevalenza relativamente alta nella popolazione, tale
da essere importante in relazione a decisioni riproduttive
(trasmissione di patologie alla prole);
Desidera 
Non desidera 
essere informato, se dovesse risultare portatore di un’alterazione
genetica di predisposizione a patologie ad insorgenza nell’adulto,
se questa conoscenza rappresentasse un beneficio concreto in
termini di terapia e/o prevenzione.
Desidera 
Non desidera 
essere informato, se dovesse risultare portatore di un’alterazione
genetica di predisposizione a patologie ad insorgenza nell’adulto,
anche se questa conoscenza non rappresentasse un beneficio
concreto in termini di terapia e/o prevenzione.
Procedure
Test negativi e duty to recontact
•E’ importante prevedere che il paziente risultato
negativo ad un’analisi NGS sia rivisto periodicamente
dal Centro di Genetica che lo segue per stabilire la
necessità di rivalutazioni alla luce di eventuali nuovi
dati.
•Problema organizzativo: richiede un’organizzazione del
centro compatibile con un grosso lavoro di
archiviazione/aggiornamento della letteratura/segreteria
per il richiamo sistematico dei pazienti risultati negativi
alle precedenti analisi.
•Non sono ancora disponibili linee guida al riguardo
Varianti: classificazione
1.
2.
3.
Varianti patogenetiche: Sono quelle varianti alle quali è
possibile attribuire con certezza un ruolo patogenetico. Si
tratta di varianti note in geni già associati a fenotipomalattia, oppure varianti non descritte che, ad esempio,
determinano una chiara perdita di funzione di un gene
noto che si associa a malattia con meccanismo di
aploinsufficienza
Varianti responsabili di fenotipi mendeliani non
collegati al quesito clinico. La definizione più usata per
designare questa classe di varianti è “risultati incidentali”
(incidental findings; IF).
Varianti di sequenza con effetti funzionali e clinici
non definiti (varianti di significato incerto; variants of
uncertain significance, VUS), le quali possono essere
identificate in geni noti già implicati nel fenotipo
presentato dal paziente, oppure in altre regioni geniche
non correlate ad esso. Il primo sottotipo di queste varianti
è comune alle tecniche di sequenziamento tradizionale.
Varianti in geni non correlati al quesito clinico
• varianti in geni noti, in base alle quali può essere predisposta una
sorveglianza medica efficace (“clinically actionable mutations”) (es.
geni di predisposizione al cancro);
• stato di portatore eterozigote per una condizione recessiva:
vanno discusse le scelte riproduttive e la possibilità di arruolare nel
test specifico altri familiari;
• varianti geniche note per essere rilevanti nella
farmacogenetica;
• varianti in geni di predisposizione (es. per malattie
neurodegenerative) per le quali non è ancora disponibile una
strategia preventiva di efficacia;
• varianti geniche di significato clinico sconosciuto (VUS).
Risultati Incidentali
Clinicamente utili
Utilità clinica
Sì
Validità clinica
Sì
Comunicazione al paziente
Sì (se dato consenso)
Esempi di geni e condizioni - Geni actionable
- Condizione di eterozigosi per
cliniche
patologie autosomiche recessive
relativamente frequenti
-rs4149056 genotipo a bassa
attività (CC)  rischio elevato di
miopatia indotta da statine
-CYP2D6 poor metabolizers
(*4/*4)  evitare uso di codeina
ACTIONABLE GENES TO BE REPORTED: CANCER PREDISPOSITION
Hereditary Breast and Ovarian Cancer BRCA1, BRCA2
AD
Li-Fraumeni Syndrome
TP53
AD
Peutz-Jeghers Syndrome
STK11
AD
Lynch Syndrome
MLH1, MSH2,
MSH6,PMS2
AD
Familial adenomatous polyposis
APC
AD
MYH-Associated Polyposis
MUTYH
AR
Von Hippel Lindau syndrome
VHL
AD
Multiple Endocrine Neoplasia Type 1
MEN1
AD
Multiple Endocrine Neoplasia Type 2
RET
AD
Familial Medullary Thyroid Cancer
(FMTC)
RET, NTRK1
AD
PTEN Hamartoma Tumor Syndrome
PTEN
AD
Retinoblastoma
RB1
AD
HereditaryParagangliomaPheochromo SDHD, SDHAF2, SDHC
cytomaSyndrome
SDHB
AD
WT1-related Wilms
AD
WT1
ACTIONABLE GENES TO BE REPORTED: MEDICAL CONDITIONS
Tuberous Sclerosis Complex
TSC1 TSC2
AD
Neurofibromatosis type 2
NF2
AD
EDS - vascular type
COL3A1
AD
Marfan Syndrome, Loeys-Dietz Syndromes,
and Familial Thoracic Aortic Aneurysms and
Dissections
FBN1 TGFBR1,TGFBR2
SMAD3, ACTA2, MYLK
MYH11
AD
Hypertrophic cardiomyopathy, Dilated
ardiomyopathy
MYBPC3, MYH7,TNNT2,
TNNI3, TPM1, MYL3,
ACTC1, PRKAG2, GLA,
MYL2, LMNA
AD, XL
Catecholaminergic polymorphic ventricular
tachycardia
RYR2
AD
Arrhythmogenic right ventricular
cardiomyopathy
PKP2, DSP, DSC2,
TMEM43, DSG2
AD
Romano-Ward Long QT Syndromes Types
1, 2, and 3, Brugada Syndrome
KCNQ1, KCNH2, SCN5A
AD
Familial hypercholesterolemia
LDLR, APOB, PCSK9
AD
Malignant hyperthermia susceptibility
RYR1, CACNS1
AD
Risultati Incidentali
Clinicamente validi ma non utili
Utilità clinica
No
Validità clinica
Sì
Comunicazione al paziente
No (sì su consenso specifico
dopo adeguata consulenza)
Esempi di geni e condizioni -APOE (malattia di
Alzheimer)
cliniche
-Otosclerosi
-Deficit alfa1-antitripsina
Risultati Incidentali
Clinicamente non utili e non validi.
Utilità clinica
No
Validità clinica
No
Comunicazione al paziente
No
Esempi di geni e condizioni -VUS in regioni non comprese nei
target specifici del test
cliniche
-Varianti polimorfiche di
suscettibilità associate a rischi di
patologia <2X rispetto alla
popolazione generale