Diapositiva 1 - Policlinico di Modena
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Aggiornamenti in tema di Genetica Medica Dr. Antonio Percesepe Genetica Medica Dipartimento Sc. Mediche e Chirurgiche Università di Modena Outline • Definizione dell’attività di un Servizio Clinico di Genetica Medica • Esempi di consulenze genetiche in epoca prenatale • Luci ed ombre delle nuove tecnologie diagnostiche nei fenotipi complessi Genetica medica Definizioni 1. La scienza delle variabilità biologica umana per quanto riguarda il suo rapporto con la salute e la malattia 2. Lo studio dell’eziologia, patogenesi e storia naturale delle malattie a base genetica 3. L’applicazione della genetica alla medicina o alla pratica medica Da: Emery and Rimoins: Principles and practice of Medical Genetics Servizi di Genetica Medica: “Servizi integrati clinici e di laboratorio forniti a soggetti e familiari affetti o a rischio di malattie con una significativa componente genetica, comprendendo in tale definizione malattie genetiche sia ereditarie che sporadiche. I principi della malattia: le basi genetiche • Perché ammaliamo? • Perché questa malattia? • Perché proprio io? • Perché proprio adesso? Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnosticoterapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Sindrome di Marfan (OMIM 154700) • • • • Manifestazioni scheletriche – alta statura – arti lunghi e sottili – aracnodattilia – scoliosi – torace escavato o a carena Manifestazioni oculari – ectopia lentis (80% degli affetti da MFS) Manifestazioni cardiovascolari – Insufficienza aortica – dilatazione dell’aorta ascendente con possibilità di complicazione nella dissecazione Altri apparati (polmoni, meningi, etc.) Analisi di mutazione nel gene FBN1 Gene di 230 Kb, costituito da 65 esoni che codificano per la proteina di struttura fibrillina Nei primi studi (SSCP o su cDNA) il tasso di mutazioni era tra il 9 ed il 23%. Oggi i tassi di mutazione oscillano tra il 57 ed il 90% Criteri di Ghent: diagnosi di certezza se combinazione di criteri maggiori in due organi ed il coinvolgimento di un terzo organo Ghent + 66% Ghent 5% Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: (a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnostico-terapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Retinite pigmentosa • • • • • Geneticamente eterogenea: forme autosomiche dominanti, autosomiche recessive, X-linked recessive, mitocondriali Isolata o sindromica? Sporadica o familiare? L'analisi ha evidenziato la mutazione c.2200G>A, p.Gly734Arg in omozigosi nel gene CRB1 (CRUMBS, DROSOPHILA, HOMOLOG OF, 1 MIM *604210). Tale mutazione non è stata mai descritta in letteratura come associata a retinite pigmentosa ma essa può esser considerata patogenetica perchè riscontrata in omozigosi anche nei due figli affetti (pseudominanza, essendo il marito, non affetto, consanguineo della paziente e quindi verosimilmente portatore della stessa mutazione genica). Non vi sono altre mutazioni nei geni analizzati. Mutazioni bialleliche di CRB1 sono responsabili di un fenotipo retinico che va da distrofie dei coni e bastoncelli ad esordio in epoca infantile o giovanile a casi classici di retinite pigmentosa. La gravità dei casi descritti è piuttosto variabile anche se in generale l'esordio tende ad esser precoce e l'andamento progressivo. In ogni caso non vi è in letteratura una correlazione tra le mutazioni descritte in CRB1 ed il fenotipo dei pazienti. RETINITE PIGMENTOSA Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: (a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnosticoterapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Neurofibromatosi tipo I • Prevalenza della malattia: 1:2500/1:5000 • Alto tasso di prime mutazioni (30-50% dei casi non ha un genitore affetto): 10-4 per allele per generazione (nella maggior parte dei casi a carico dell’allele paterno) Noduli di Lisch Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnostico-terapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Pannello geni distrofie retiniche GENE DISEASE ABCA4 RP19/Stargardt1 # EXON CHROMOSOME 48 1p 1:10000 prevalence GENE BEST1 RP50 6 11q CA4 RP17 8 17q CRX RP 4 19q ELOVL 4 Starga rdt3 6 6q FSCN2 RP30 5 17q GUCA 1B RP48 4 6p 3% adRP IMPD H1 RP10; LCA11 17 7q 2% adRP KLHL7 RP42 14 7p 1-2% adRP 1-3% LCA NRL2 E3 RP37 8 15q 1p 10%RP in Israel NRL RP27 3 14q 35 6q 10-20%arRP OTX2 LCA 4 14q RP28 7 2p PRPF3 RP18 16 1q GUCY2D LCA1 20 17p PRPF6 RP60 21 20q IDH3B RP46 11 20p PRPF8 RP13 43 17p IMPG2 RP56 19 3q IQCB1 LCA 15 3q PRPF3 1 RP11 14 19q 2.5% adRP KCNJ13 LCA16 3 2q PRPH 2 RP7 3 6p 5% adRP LCA5 LCA5 9 6q LRAT RP; LCA14 3 4q RDH1 2 RP 9 14q MAK RP62 14 6p24 RHO RP4 5 3q MERTK RP38 19 2q NMNAT1 LCA9 5 ROM1 RP7di genic 3 11q NR2E3 RP ORP1 RP1 4 8q NRL RP PAP1 RP9 6 7p AILP1 5-10% LCA LCA4 6 17p C2ORF71 RP54 2 2p C8ORF37 RP64; CRD16 6 8q22 CABP4 LCA 6 11q CEP290 LCA10 52 12q CERKL RP26 12 2q CLRN1 RP61 5 3q CNGA1 RP49 10 4p 2.3%arRP CNGB1 RP45 31 16q rare CNGB3 Stargardt 18 8q CRB1 RP12; LCA8 12 1q CRX LCA7 DHDDS RP59 9 EYS RP25 FAM161A BEST1 1p36.22 20% LCA 9-13% LCA 20% arLCA; 40%adCRD6 # EXON CHRO MOSO ME DISEA SE IMPACT 1-3% LCA 10%RP; 28% adRP 510%adRP • L'analisi ha evidenziato la presenza della mutazione c.785C>G (p.Ala262Gly) nel gene RPGR ("RETINITIS PIGMENTOSA GTPase REGULATOR; MIM*312610), localizzato sul cromosoma X e responsabile, quando mutato, della forma legata all'X di retinite pigmentosa. Non sono state riscontrate variazioni significative in alcuno degli altri geni studiati. • La mutazione non è mai stata riportata in pazienti affetti da retinite pigmentosa (fonte: database Retina International), ma viene valutata come patogenetica dai softwares di predizione informatica e può esser considerata causativa della malattia. Anche la trasmissione madre-figlio della retinite pigmentosa malattia è compatibile con la localizzazione del gene sul cromosoma X, in quanto per il gene RPGR sono state descritte molte donne eterozigoti per la mutazione di RPGR affette da forme con età di insorgenza e gravità del tutto indistinguibili da quelle del sesso maschile. Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: (a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnostico-terapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Valutazione clinica della malformazione Diagnosi di accettazione: Lesione da briglie amniotiche Eziopatogenesi delle malformazioni congenite dell’arto superiore 35% 31% 24% 6 % 4% vascolare complessa monogenica cromosomica da teratogeni PROGNOSI GENETICA: RISCHIO DI RICORRENZA PARI A QUELLO DELLA POPOLAZIONE GENERALE Valutazione clinica e radiologica dei genitori Sindattilia 4-5° dito della mano Le brachidattilie isolate: classificazione Difetti di penetranza ed espressivita’ variabile Le brachidattilie Le brachidattilie isolate: classificazione Cosa fa il genetista clinico Il genetista clinico deve essere in grado di: (a) diagnosticare e trattare le malattie a base genetica b) utilizzare le conoscenze di eterogeneità, variabilità e storia naturale delle malattie genetiche nel processo decisionale diagnostico-terapeutico dei pazienti c) richiedere ed interpretare le storie individuali e familiari d) interpretare le informazioni genetiche cliniche e di test di laboratorio specializzati e) spiegare le cause e la storia naturale delle malattie genetiche e fornire una stima del rischio genetico f) interagire con altri professionisti del campo della salute nel fornire servizi per i pazienti con malattie a base genetica Ruolo del genetista medico nell’iter diagnosticoterapeutico delle malattie in epoca pediatrica • Negli iter diagnostici che prevedono la presenza del dismorfologo, il genetista si pone come interfaccia tra questo e la famiglia • Conferma la diagnosi posta o ne formula una diversa, aiutato anche dalle informazioni genetiche • Nei casi ove non si conosca il gene formula prognosi genetiche per la predizione dei rischi e delle caratteristiche di ricorrenza • Nei casi ove si conosce il gene organizza la diagnosi genomica avvalendosi dei laboratori regionali, nazionali, internazionali che li eseguono • In entrambi i casi conclude con una consulenza scritta Distribuzione territoriale centri di Genetica Medica e rapporto con la popolazione Area Northern Central Southern Islander Total Italy Region Living population Medical genetic centres Population/no. centres ratio Emilia Romagna 4 151 369 20 207.568 Friuli 1 204 718 7 172.103 Liguria 1 592 309 11 144.755 Lombardia 9 393 092 42 223.645 Piemonte 4 330 172 14 309.298 Trentino Alto Adige 974 613 3 324.871 Valle D'Aosta 122 868 1 122.868 Veneto 4 699 950 27 174.072 Lazio 5 269 972 27 195.184 Marche 1 518 780 3 506.260 Toscana 3 598 269 16 224.892 Umbria 858 938 5 171.788 Abruzzo 1 299 272 3 433.091 Basilicata 596 546 3 198.849 Calabria 2 009 268 5 401.854 Campania 5 788 986 22 263.136 Molise 321 953 2 160.977 Puglia 4 068 167 18 226.009 Sardegna 1 650 052 6 275.009 Sicilia 5 013 081 21 238.718 58 462 375 256 228.369 Test genetici Analisi di specifici geni, del loro prodotto o della loro funzione, nonché ogni altro tipo di indagine del DNA o dei cromosomi, finalizzate ad individuare o ad escludere modificazioni del genoma, verosimilmente associate a patologia umana Test diagnostici (o sintomatici) Sono finalizzati a stabilire o a confermare una diagnosi clinica o un quadro patologico sospettato, ma non definitivamente inquadrato dalla obiettività clinica. Alcuni di questi test vengono utilizzati per identificare gli eterozigoti (o portatori sani) per mutazioni comuni, i quali presentano un aumento del rischio riproduttivo qualora anche i propri partner siano eterozigoti per lo stesso gene mutato Test presintomatici o preclinici Identificano mutazioni che inevitabilmente portano alla comparsa di una malattia prima del suo esordio clinicamente evidenziabile. Per definizione, sono presintomatici i test applicati nella diagnosi prenatale e quelli che, all’interno delle famiglie a rischio, identificano i portatori di geni associati a malattie ad esordio tardivo CONSENSO INFORMATO PER L’ESECUZIONE DI ANALISI GENETICHE Il sottoscritto/a ___________________________________________________________________ Nato/a __________________________________________ (Prov_________) il________________ Residente in__________________________________ (Prov_________) CAP _________________ Via_____________________________________N°______ Tel _____________________________ DICHIARA di aver ricevuto informazioni riguardo gli aspetti genetici della malattia presente nella famiglia e/o da cui è affetto e di aver compreso l’utilità dell’analisi genetica proposta e dei suoi eventuali limiti. ACCONSENTE quindi al prelievo a cui si sta sottoponendo per l’analisi: ________________________________________________________________________________________________ DICHIARA inoltre di Volere NON volere essere informato circa i risultati dell’analisi Volere NON volere contattare altri membri della famiglia il cui coinvolgimento potrebbe essere rilevan te ai fini delle analisi genetiche Volere NON volere che il DNA estratto possa essere utilizzato in futuro per ulteriori indagini a fini dia gnostici Volere NON volere che il DNA estratto possa essere eventualmente utilizzato in forma anonima per studi di interesse genetico Volere NON volere autorizzare l’acquisizione di fotografie che documentano il caso Volere NON volere autorizzare l’impiego e la pubblicazione dei dati, anche fotografici, in forma anonima, per sco pi scientifici Il personale sanitario che ha accesso ai dati personali si attiene alle norme della Legge sulla privacy: Decreto legislativo 30 giugno 2003 n. 196 - Codice in materia di protezione dei dati personali Il sottoscritto/a si impegna a comunicare tempestivamente ogni eventuale cambiamento di opinione in merito a quanto dichiarato. Data_________________________ Firma __________________________________ Il Genetista che ha raccolto il Consenso informato _______________________________________ Consulenza genetica prenatale • Richiesta principalmente a scopo prognostico • Rapidità nell’accesso • Prognosi chiaramente comprensibile di malattie scarsamente conosciute • Non direttività • Uso limitato di accertamenti per i limiti temporali dell’IVG • Correlazione genotipo/fenotipo difficile • Scarse possibilità di anticipare le conseguenze della malattia in termini di gravità e controlli da eseguire a fronte di una necessità di scelta in termini di gravità della patologia Women who receive a prenatal diagnosis of a chromosome abnormality remember the circumstances precisely. Years later they recall the exact words used to deliver the news, and many regret the manner in which they were told. They read between the lines messages that their fetus is no longer worthy of life and that their feelings about the pregnancy are not important. A test result showing that a fetus has a chromosomal difference leaves women and their partners with a permanent and life altering decision whether or not to continue the preg nancy. Discondrosteosi di Leri-Weill 1 2 I 1 2 3 II S H O X 0.5 1 1.5 0.5 1 1.5 0.5 1 1.5 0.5 1 1.5 0.5 1 1.5 I:1 I:2 II:1 II:2 II:3 1 5 10 15 ENH IL3RA ASMT C O N T R O L 20 25 30 35 40 45 Onfalocele ricorrente S. di Beckwith-Wiedemann CLINICA – Iperaccrescimento prenatale – Macroglossia – Onfalocele – Visceromegalia – Emi-ipertrofia – Aumentata suscettibilità ai tumori infantili, in particolare tumore di Wilms s. di Beckwith Wiedmann familiare Curve di crescita prenatali I disordini genomici • Le s. da microdelezione/duplicazione appartengono ai disordini genomici, termine che indica una sindrome costituzionale, spesso con ritardo mentale ed anomalie multiple del fenotipo, causata da riarrangiamenti strutturali di particolari regioni cromosomiche • Tali riarrangiamenti sono un evento non casuale, in quanto mediato dalla presenza di sequenze di DNA ripetitivo, note come dupliconi, o regioni LCR (Low Copy Repeats), blocchi di poche sequenze ripetute con elevata omologia reciproca (94-99%) • Tali sequenze rappresentano circa il 10% dell’intero genoma, ma sono localizzate in siti specifici Ideogramma con le principali localizzazioni di delezioni e duplicazioni cromosomiche Overview delle localizzazioni di tutte le microdelezioni/duplicazioni riportate sul database DECIPHER Riscontro occasionale di microdelezione 15q13.3 • • • • • • Giunge in consulenza per una valutazione prognostica di un riarrangiamento genomico riscontrato su prelievo di villi coriali eseguito in data …..: nella fattispecie, l'analisi dei riarrangiamenti genomici mediante array CGH, eseguito per scelta materna, ha evidenziato la presenza di una microdelezione di 537 Kb a carico del braccio lungo del cromosoma 15 (regione 15q13.3), coinvolgente il gene CHRNA7. Tale delezione, dopo verifica sui genitori, è risultata de novo. L’analisi cariotipica diretta su villi coriali ha evidenziato un cariotipo maschile normale. L'esame colturale è tuttora in corso. Ecograficamente non sono state riscontrate anomalie Sulla base di tali dati si possono fare le seguenti considerazioni: • La microdelezione 15q13.3 riscontrata occasionalmente in corso di diagnosi prenatale rappresenta una condizione di significativo rischio per l'insorgenza di disturbi neuropsichiatrici, che comprendono la disabilità intellettiva, i disturbi dello spettro autistico, la schizofrenia, i deficit attentivi ed i problemi comportamentali. La penetranza totale di tale delezione si avvicina all'80%, anche se la microdelezione riscontrata nella sig.ra .......i è atipica, ovvero più piccola della classica delezione 15q13.3, ma coinvolge la regione critica del gene CHRNA7. In tali situazioni, il rischio di disturbi neuropsichatrici non differisce significativamente dalle forme classiche di delezione. Non vi è aumentato rischio malformativo. • Anche se la delezione è frequentemente ereditata da genitori definiti come normali, studi di larga scala su controlli normali adulti non hanno riscontrato tali riarrangiamenti se non in percentuali bassissime (uno studio Islandese su più di 100.000 individui ha riscontrato la microdelezione 15q13.3 atipica soltanto nello 0,0078% dei casi), escludendone pertanto il ruolo di variante priva di significato patogenetico. In conclusione, sulla base delle conoscenze attuali, la prognosi genetica per la gravidanza in atto è la seguente: Elevato rischio di disturbi neuropsichiatrici (80%) in assenza di quadri ecografici prenatali malformativi Ruolo del genetista medico nell’iter diagnostico prenatale complesso • Negli iter diagnostici complessi, il genetista si pone come interfaccia tra il ginecologo e la famiglia • Integra la diagnosi posta aiutato anche dalle informazioni genetiche • Nei casi ove non si conosca il gene formula prognosi genetiche per la predizione del rischio fetale e delle caratteristiche di ricorrenza nelle future gravidanze • Nei casi ove si conosce il gene organizza la diagnosi genomica avvalendosi dei laboratori regionali, nazionali, internazionali che li eseguono • In tutti i casi conclude con una consulenza scritta non direttiva Next generation sequencing (NGS) NGS: tipologia esoma Intero genoma Tipologia di analisi: analisi mutazionale Mutation scanning (for individual or small sets of genes). • A typical example is the use of NGS platforms for amplicon based re-sequencing of the BRCA1 and BRCA2 genes that have been extensively characterized previously, and for which testing usually encompasses Sanger sequencing of the coding region (and flanking intronic sequences) plus deletion/duplication analysis, • The NGS test should have at least the same sensitivity and specificity as the current diagnostic offer. Reporting would basically not be different from earlier reporting on BRCA1 and BRCA2 screening. Situazione in Emilia Romagna • Da parte di numerosi laboratori di diagnostica genetica è in atto un travaso dei test classicamente eseguiti mediante sequenziamento tradizionale sec. Sanger in NGS (es. BRCA1 e BRCA2), colmando con il sequenziamento tradizionale le regioni non adeguatamente indagate in NGS Tipologia di analisi: esoma Exome sequencing shall actually be divided into 2 different applications. • One is about targeted analysis for known genes, and the instructions are similar to the ones given for targeted mutation screening, except that aspects of unsolicited findings, and thus of informed consent, are to be dealt with more extensively. • The other application is the use of the exome for the identification of novel genetic defects. This largely remains in the realm of research, especially if the genes in which mutations are identified, have not been previously associated with the particular disease; i.e. it is difficult to offer such a thorough analysis in diagnostics. An exception to that view is the use of exome sequencing in trios (patient and parents) for the identification of de novo defects. Comparazione tra Targeted Resequencing e Targeted Data Analysis. • • Pannelli “pre-sequenziamento” (Targeted Resequencing): permettono l’arricchimento di specifiche regioni genomiche prima del sequenziamento, così da analizzare un certo numero di pazienti in contemporanea e abbattere i costi. Appropriato nell’analisi di quelle patologie per le quali mutazioni in geni già noti coprono la maggior parte dei casi Pannelli “in silico” (Targeted Data Analysis): in questo caso si effettua un WES e successivamente si vanno ad analizzare solo quei geni già noti per essere associati alla patologia in esame. In questo caso è possibile analizzare solo pochi campioni per corsa, a seconda del tipo di strumentazione di cui si dispone, e i costi sono maggiori. Il vantaggio ovvio di questo approccio è che l’aggiornamento non richiede nessuna modifica al disegno e alla piattaforma di arricchimento e permette, senza ulteriori costi, di analizzare “nuovi” geni malattia in pazienti già sequenziati. Inoltre, nel momento in cui una rivalutazione clinica del paziente facesse emergere un sospetto differente da quello iniziale, può essere sufficiente cambiare il “target” dell’analisi. Definizione di test diagnostico e test di ricerca TEST DIAGNOSTICO • Un test diagnostico è qualsiasi test usato per la diagnosi di una malattia. In genetica questo significa che un individuo viene studiato per cercare varianti probabilmente patogeneiche che possano spiegare il fenotipo o per escluderle ed escludere contemporaneamente il rischio familiare • Il test diagnostico può esser specifico (sequenza della mutazione famiiliare), o generale (come nella ricerca di CNV nella disabilità intellettiva). I test diagnostici vengono eseguiti presso laboratori specializzati sottoposti a controlli di qualità ed accreditamento. TEST DI RICERCA • Un test di ricerca è sotteso da un’ipotesi che può esser vera o meno ed avere un impatto clinico molto limitato sul paziente • I risultati ottenuti da un test di ricerca devono esser confermati presso un laboratorio accreditato prima di esser trasferiti al paziente ed al suo curante • Sia nei test diagnostici che di ricerca le varianti riscontrate nei soggetti nromali e le varianti patogenetiche nei soggetti affetti dovrebbero esser condivisa su database locali o internazionali (ne sono già presenti numerosi) Pannello distrofie retiniche (72 geni) nell’ambito del Progetto RARER GENE DISEASE ABCA4 RP19/Stargardt1 AILP1 # EXON CHROMOSOME 48 1p 1:10000 prevalence LCA4 6 17p 5-10% LCA C2ORF71 RP54 2 2p C8ORF37 RP64; CRD16 6 8q22 CABP4 LCA 6 11q CEP290 LCA10 52 12q CERKL RP26 12 2q CLRN1 RP61 5 3q CNGA1 RP49 10 4p 2.3%arRP CNGB1 RP45 31 16q rare CNGB3 Stargardt 18 8q CRB1 RP12; LCA8 12 1q CRX LCA7 DHDDS RP59 9 1p 10%RP in Israel EYS RP25 35 6q 10-20%arRP FAM161A RP28 7 2p GUCY2D LCA1 20 17p IDH3B RP46 11 20p IMPG2 RP56 19 3q IQCB1 LCA 15 3q BEST1 20% LCA 9-13% LCA 1-3% LCA 20% arLCA; 40%adCRD6 Tipologia di analisi: Whole genome sequencing • Whole genome sequencing (WGS) will certainly come of age very soon. Laboratories that plan to offer WGS in a diagnostic context will have to deal with additional aspects, beyond the ones presented in the current guidelines. Still, the basics of NGS diagnostics will apply, including minimal technical achievements, diagnostic utility and informed consent issues. Quale tipo di NGS? Per la scelta dell’approccio si tiene conto di diversi fattori: • Costi: l’uso di pannelli genici è privilegiato per motivazioni economiche, ma il divario di costi si è progressivamente assottigliato: oggi ill sequenziamento di un esoma può essere infatti meno dispendioso del sequenziamento di un pannello di geni • Finalità: in generale, le tecniche NGS trovano applicazione nel caso di – malattie ad alta eterogeneità genetica (targeted resequencing o esoma?) – patologie genetiche su base mendeliana con gene non ancora identificato (esoma o WES?). • • • Sensibilità: questa è funzione soprattutto del coverage delle sequenze indagate, ovvero dal numero di “letture” (reads) dei singoli tratti di DNA esaminati e dal grado di sovrapposizione tra queste. Probabilità di ottenere Risultati Incidentali e Varianti di Significato Incerto: dipendono dall’ampiezza della porzione di genoma analizzata e interrogata. L’analisi basata su pannelli è difficilmente associata a IF, poiché le sequenze analizzate sono per definizione implicate nella condizione clinica presentata dal probando. Archiviazione dei dati: quanto più ampia la porzione di genoma analizzata, tanto maggiore è il volume di dati prodotti. E’ necessario quindi che siano disponibili o accessibili adeguate piattaforme per l’archiviazione, soprattutto per analisi che producono una grande quantità di dati, come WES e, ancor più, WGS. Raccomandazioni operative per i test NGS • • • • • La caratterizzazione fenotipica è fondamentale per la scelta della tecnica di diagnosi molecolare (sequenziamento Sanger, Targeted resequencing, WES) e per la successiva analisi delle varianti identificate. Nel caso di fenotipi con bassa eterogeneità genetica, può essere opportuno valutare l’analisi con metodiche molecolari convenzionali. In generale, è auspicabile che l’analisi molecolare di geni molto grandi (numerosi esoni) sia trasferita su piattaforme NGS per l’abbattimento dei costi e dei tempi di refertazione. Nel caso di condizioni con elevata eterogeneità genetica nelle quali mutazioni in un numero ridotto di geni sono responsabili della maggioranza dei casi (> del 50%) è auspicabile l’uso di un targeted resequencing. Tale strategia è indicata anche in caso di sospetto mosaicismo. Nel caso di condizioni con eterogeneità genetica particolarmente marcata dove è coinvolto un numero sempre crescente di geni, ma ognuno è responsabile di una bassa percentuale di casi (per esempio paraparesi spastiche ereditarie, retiniti pigmentose, etc.) è indicata l’esecuzione di un WES con analisi limitata al pannello di geni responsabili (pannello “in silico”). In caso di negatività dell’analisi di un pannello di geni, i dati esomici restano quindi a disposizione per le eventuali indagini successive indirizzate alla ricerca di nuovi geni candidati o per l’analisi di geni causativi identificati in un secondo tempo. Infine in tutti i casi in cui non può essere formulata un’ipotesi diagnostica su base clinica è preferibile l’analisi dell’intero esoma per l’individuazione del difetto genetico responsabile, che può riguardare mutazioni/geni già noti (ambito diagnostico) o nuovi geni candidati (ambito di ricerca). E’ auspicabile che tali indagini siano eseguite in centri con comprovata esperienza nell’ambito dell’analisi di dati esomici per garantire la più alta probabilità di successo, che al momento, secondo la letteratura medica, si attesta attorno al 25% Procedure Consenso informato ed informativa al paziente ed al medico E’ necessario informare su: • la malattia che viene analizzata, • il nome dei geni testati, • la sensibilità e specificità • se vi sono delle malattie non rilevanti al fenotipo clinico che potrebbero esser causate da mutazioni nel gene testato (es. sordità in alcuni geni della retinite pigmentosa) • La pipeline di analisi dei laboratori diagnostici deve focalizzarsi ed esser validata sul pannello genico oggetto dell’indagine per evitare la possibilità di risultati incidentali • I laboratori comunque dovranno informare sulla possibilità di risultati incidentali Consenso informato Specificità dell’NGS in merito a risultati inattesi Desidera Non desidera essere informato, se dovesse risultare portatore “sano” di patologie genetiche con prevalenza relativamente alta nella popolazione, tale da essere importante in relazione a decisioni riproduttive (trasmissione di patologie alla prole); Desidera Non desidera essere informato, se dovesse risultare portatore di un’alterazione genetica di predisposizione a patologie ad insorgenza nell’adulto, se questa conoscenza rappresentasse un beneficio concreto in termini di terapia e/o prevenzione. Desidera Non desidera essere informato, se dovesse risultare portatore di un’alterazione genetica di predisposizione a patologie ad insorgenza nell’adulto, anche se questa conoscenza non rappresentasse un beneficio concreto in termini di terapia e/o prevenzione. Procedure Test negativi e duty to recontact •E’ importante prevedere che il paziente risultato negativo ad un’analisi NGS sia rivisto periodicamente dal Centro di Genetica che lo segue per stabilire la necessità di rivalutazioni alla luce di eventuali nuovi dati. •Problema organizzativo: richiede un’organizzazione del centro compatibile con un grosso lavoro di archiviazione/aggiornamento della letteratura/segreteria per il richiamo sistematico dei pazienti risultati negativi alle precedenti analisi. •Non sono ancora disponibili linee guida al riguardo Varianti: classificazione 1. 2. 3. Varianti patogenetiche: Sono quelle varianti alle quali è possibile attribuire con certezza un ruolo patogenetico. Si tratta di varianti note in geni già associati a fenotipomalattia, oppure varianti non descritte che, ad esempio, determinano una chiara perdita di funzione di un gene noto che si associa a malattia con meccanismo di aploinsufficienza Varianti responsabili di fenotipi mendeliani non collegati al quesito clinico. La definizione più usata per designare questa classe di varianti è “risultati incidentali” (incidental findings; IF). Varianti di sequenza con effetti funzionali e clinici non definiti (varianti di significato incerto; variants of uncertain significance, VUS), le quali possono essere identificate in geni noti già implicati nel fenotipo presentato dal paziente, oppure in altre regioni geniche non correlate ad esso. Il primo sottotipo di queste varianti è comune alle tecniche di sequenziamento tradizionale. Varianti in geni non correlati al quesito clinico • varianti in geni noti, in base alle quali può essere predisposta una sorveglianza medica efficace (“clinically actionable mutations”) (es. geni di predisposizione al cancro); • stato di portatore eterozigote per una condizione recessiva: vanno discusse le scelte riproduttive e la possibilità di arruolare nel test specifico altri familiari; • varianti geniche note per essere rilevanti nella farmacogenetica; • varianti in geni di predisposizione (es. per malattie neurodegenerative) per le quali non è ancora disponibile una strategia preventiva di efficacia; • varianti geniche di significato clinico sconosciuto (VUS). Risultati Incidentali Clinicamente utili Utilità clinica Sì Validità clinica Sì Comunicazione al paziente Sì (se dato consenso) Esempi di geni e condizioni - Geni actionable - Condizione di eterozigosi per cliniche patologie autosomiche recessive relativamente frequenti -rs4149056 genotipo a bassa attività (CC) rischio elevato di miopatia indotta da statine -CYP2D6 poor metabolizers (*4/*4) evitare uso di codeina ACTIONABLE GENES TO BE REPORTED: CANCER PREDISPOSITION Hereditary Breast and Ovarian Cancer BRCA1, BRCA2 AD Li-Fraumeni Syndrome TP53 AD Peutz-Jeghers Syndrome STK11 AD Lynch Syndrome MLH1, MSH2, MSH6,PMS2 AD Familial adenomatous polyposis APC AD MYH-Associated Polyposis MUTYH AR Von Hippel Lindau syndrome VHL AD Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 MEN1 AD Multiple Endocrine Neoplasia Type 2 RET AD Familial Medullary Thyroid Cancer (FMTC) RET, NTRK1 AD PTEN Hamartoma Tumor Syndrome PTEN AD Retinoblastoma RB1 AD HereditaryParagangliomaPheochromo SDHD, SDHAF2, SDHC cytomaSyndrome SDHB AD WT1-related Wilms AD WT1 ACTIONABLE GENES TO BE REPORTED: MEDICAL CONDITIONS Tuberous Sclerosis Complex TSC1 TSC2 AD Neurofibromatosis type 2 NF2 AD EDS - vascular type COL3A1 AD Marfan Syndrome, Loeys-Dietz Syndromes, and Familial Thoracic Aortic Aneurysms and Dissections FBN1 TGFBR1,TGFBR2 SMAD3, ACTA2, MYLK MYH11 AD Hypertrophic cardiomyopathy, Dilated ardiomyopathy MYBPC3, MYH7,TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL3, ACTC1, PRKAG2, GLA, MYL2, LMNA AD, XL Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia RYR2 AD Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy PKP2, DSP, DSC2, TMEM43, DSG2 AD Romano-Ward Long QT Syndromes Types 1, 2, and 3, Brugada Syndrome KCNQ1, KCNH2, SCN5A AD Familial hypercholesterolemia LDLR, APOB, PCSK9 AD Malignant hyperthermia susceptibility RYR1, CACNS1 AD Risultati Incidentali Clinicamente validi ma non utili Utilità clinica No Validità clinica Sì Comunicazione al paziente No (sì su consenso specifico dopo adeguata consulenza) Esempi di geni e condizioni -APOE (malattia di Alzheimer) cliniche -Otosclerosi -Deficit alfa1-antitripsina Risultati Incidentali Clinicamente non utili e non validi. Utilità clinica No Validità clinica No Comunicazione al paziente No Esempi di geni e condizioni -VUS in regioni non comprese nei target specifici del test cliniche -Varianti polimorfiche di suscettibilità associate a rischi di patologia <2X rispetto alla popolazione generale
