proteine

INTRODUZIONE ALLA
BIOCHIMICA DELLE
PROTEINE
BCP 1-2
Pietre miliari
•
•
•
•
•
•
•
•
Lehninger 1973 “Biochemistry”
Biochemistry
Proteine ricombinanti
Protein engineering
Cristallografia, NMR, EM, MS,
spettroscopie ...
Computing
Bi i f
Bioinformatica
ti
Genomica
...
Pietre miliari
• Le proteine supportano ogni reazione che avviene in
un sistema biologico
g
• Le proteine compongono il 50% del peso secco della
presenti in percentuali
p
molto maggiori
gg
cellula;; sono p
a quelle delle altre macromolecole cellulari
• Ca. 1839 Johannes Mulder e Jakob Berzelius ( C, N,
O, H in gelatina, albumina, ...). Proteus ...Æ proteine
• Almeno 40 Premi Nobel per la Chimica o per Biologia
e Medicina sono stati assegnati in relazione a studi
su proteine
Alcune Funzioni delle Proteine
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Enzimi/catalizzatori
Proteine contrattili o strutturali
Proteine di trasporto
Eff tt i
Effettori
Proteine di difesa
Proteine per il trasporto elettronico
Recettori
Repressori
Chaperoni
Proteine di deposito
...
TRIPSINA
ACTINA
Hb
INSULINA
Ab
Cyt OXID
CD4
Jun
GroEl
FERRITINA
Peso molecolare vs.
vs Mr
• Mr e’ la massa molecolare relativa a 1/12 della massa
dell’isotopo 12C (che vale esattamente 12 u.m.a.). Mr
e’ un rapporto, e quindi ADIMENSIONALE.
• 1 Da equivale alla massa di 1 g / N (6.022 x 1023).
Spesso si usa il Da per indicare il “peso molecolare”,
che quindi rappresenta la massa,
massa espressa in g
g, di
una mole di proteina. Il “peso molecolare” ha
dimensoni di g/mole.
• Dal punto di vista pratico Mr e peso molecolare
g
usati indifferentemente.
vengono
Perche’ le PROTEINE?
Perche
• 27.000 ORF nel genoma umano
• 90.000 proteine (splicing alternativo, mod.
post-traduzionali,, assemblaggi
p
gg quaternari)
q
)
• Fibrosi cistica: delezione di 1 residuo/1500
aa
• Anemia falciforme: 2 residui mutati (EÆV) /
574 aa
• Cancro ...
g design
g
• Drug
Aminoacidi
•
•
•
•
Ala: m
m.w.
w 89
89, p
p.f.
f 314°C
314 C
Acido propionico: m.w. 74, p.f. -20.8°C
P
Proprieta’
i t ’ acido-base
id b
Eq. Henderson-Hasselbach
pH = pKa + log[A-]/[HA]
Proprietà generali
Le forme ioniche degli aminoacidi, senza considerare alcuna ionizzazione
delle catene laterali.
Proprietà acidoacido-base
pKa degli aminoacidi
I valori di pKa del gruppo
carbossilico ed aminico degli altri
aminoacidi sono simili a quelli della
glicina.
Alcuni
aminoacidi
contengono
anche catene laterali ionizzabili:
Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys e Arg.
Il pKa delle catene laterali ionizzabili
degli aminoacidi è compreso tra i
valori 3.9 (Asp) e 12.5 (Arg).
V. 3 animated lessons
Proprietà acidoacido-base
pK degli aminoacidi
Un aminoacido, come Gly, contiene due gruppi ionizzabili: un gruppo
carbossilico e un gruppo aminico protonato.
Quando si aggiunge una base (per esempio
OH-), si ha la titolazione di questi due
gruppi.
Nella glicina il pKa del gruppo
–COOH è 2.4 (per cui a pH > 2.4
sii ha
h la
l forma
f
–COO
COO-),
) mentre
t
quello del gruppo –NH3+ è 9.8
(per cui solo a pH > 9.8 si ha la
forma –NH2).
)
Proprietà acidoacido-base
Acido
glutammico
Lisina
Proprietà generali
Tutti gli aminoacidi (ad eccezione della glicina) derivati da proteine sono
otticamente attivi, cioè ruotano il piano di polarizzazione della luce.
Le molecole
l l otticamente
i
attive
i
sono
asimmetriche in modo da non essere
sovrapponibili con le loro immagini
speculari (enantiomeri).
(enantiomeri)
Ciò è caratteristico di molecole
contenenti atomi di carbonio tetraedrici
con 4 diversi sostituenti.
sostituenti
L’atomo centrale si dice centro chirale.
Proprietà generali
Il centro chirale degli aminoacidi
è l’atomo Cα.
Tutti gli aminoacidi derivati da
proteine hanno una configurazione
stereochimica di tipo L.
La configurazione assoluta degli aminoacidi L può essere facilmente
ricordata:
- guardando verso il Cα dal suo atomo H, gli altri atomi sostituenti formano,
se letti in senso orario, la parola CORN.
Il legame peptidico
Gli aminoacidi polimerizzano durante
la sintesi delle proteine mediante la
formazione di legami peptidici.
Il legame peptidico C–N si ha quando
il gruppo carbossilico
b ili
di un peptide
tid
condensa con il gruppo amminico del
peptide
successivo
mediante
ll’eliminazione
eliminazione di una molecola
d’acqua.
Il legame peptidico
Il gruppo peptidico ha una struttura
rigida e planare, dovuta al parziale
(~40 %) carattere di doppio legame del
legame
g
peptidico.
p
p
O
O-
C
C
N
N+
H
H
Il legame peptidico
Il legame peptidico C–N è 0.13 Å più corto del legame singolo N–Cα e 0.08 Å
più lungo di un doppio legame C=N.
Il legame peptidico, quindi, presenta per il 60 % una natura di legame singolo
e per il 40 % una natura di legame doppio.
Il legame peptidico
trans
Generalmente il gruppo peptidico
assume la conformazione trans
- atomi ((Cα)n e ((Cα)n+1 opposti
pp
rispetto
p
al
legame peptidico C–N.
cis
In alcuni casi il gruppo peptidico può
assume la conformazione cis
( 8
(~8
kJ
kJ·mol
l-11
meno
stabile
bil
d ll
della
conformazione trans. Problemi sterici,
perché distanza Cα-Cα = 2.8 Å).
Il legame peptidico
Il gruppo peptidico ha un momento di
dipolo.
Gli atomi O e N sono rispettivamente
p
più
p
elettronegativi di C ed H. La conseguente
delocalizzazione di carica porta alla
formazione di due dipoli (CO ed NH) con
analoga direzione e verso nel gruppo
peptidico.
Il momento di dipolo
di l risultante
i l
è di circa
i
3.5 Debye.
O
C
N
H
Macromolecole Biologiche
Il legame peptidico
Come si ricava il valore del momento di dipolo del gruppo peptidico:
momento dipolo C=O (frazione di carica × distanza atomi C ed O):
μA = 0.42 × 1.23 = 0.52 eÅ
momento dipolo N–H (frazione di carica × distanza atomi N ed H):
μB = 0.20 × 1.00 = 0.20 eÅ
Il momento di dipolo risultante sarà dato dalla somma: μ = μA + μB = 0.72 eÅ
Å
Nel sistema internazionale il momento di dipolo è espresso in Cm, quindi:
0 72 × 1.6
0.72
1 6 × 10-19 × 10-10 = 1.15
1 15 × 10-29 Cm
carica e- Å in metri
poiché 1 Debye = 3.35 × 10-30 Cm, ne deriva che 1.15 × 10-29 Cm equivale a
circa 3.5 Debye.
Il legame peptidico
Per ciascun aminoacido costituente la catena polipeptidica si presentano 20
diverse possibilità di catena laterale (o residui),
residui) per cui è facile immaginare
l’enorme numero di diverse catene polipeptidiche che possono essere
costituite.
Se si considera un dipeptide, si avranno 202 = 400 possibili dipeptidi diversi.
Se si considera un tripeptide, si avranno 203 = 8000 possibili tripeptidi diversi.
Nel caso delle proteine,
proteine una piccola proteina è costituita da una singola catena
polipeptidica di circa 100 residui, per cui si avranno 20100 = 1.27 × 10130
possibili catene polipeptidiche diverse!
Gli organismi sulla terra sintetizzano un gran numero di proteine, con
caratteristiche fisico-chimiche differenti, che derivano dalle diverse proprietà
dei 20 aminoacidi ‘standard’ e da come questi si combinano nella catena
polipeptidica.
li tidi
Gli aminoacidi
http://www biology arizona edu/biochemistry/problem sets/aa/aa html
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/aa/aa.html
http://www.imb-jena.de/IMAGE_AA.html
20 catene laterali diverse per gli aminoacidi:
aminoacidi:
classificazione e caratteristiche
Le 20 diverse catene laterali (gruppo R) che costituiscono
gli aminoacidi si differenziano considerevolmente per
dimensioni, volume e per le loro caratteristiche fisico
chimiche, quali polarità, acidità, basicità, aromaticità,
flessibilità conformazionale, reattività chimica,
tendenza a formare legami idrogeno.
Q
Queste
diverse caratteristiche sono le maggiori
gg
responsabili
p
della g
grande
varietà di proprietà delle proteine.
Per convenzione, i nomi degli aminoacidi sono abbreviati con un codice a tre
lettere e con uno a una lettera.
Gli aminoacidi sono generalmente classificati a seconda della polarità delle
loro catene laterali.
Infatti,, il ripiegamento
p g
della catena p
polipeptidica
p p
nella sua conformazione
nativa è dovuto principalmente alla tendenza che hanno le catene laterali
idrofobiche a sfuggire il contatto con il solvente e le catene laterali idrofiliche
ad essere esposte all’acqua.
Si possono quindi distinguere 3 gruppi di aminoacidi:
- gruppo R non polare
- gruppo R polare non carico
- gruppo R polare carico
Gruppo R non polare
Glicina
Gly
Alanina
Ala
Valina
Val
Leucina
Leu
Isoleucina
Ile
Metionina
Met
Prolina
Pro
Fenilalanina
Phe
Ti t f
Triptofano
T
Trp
G
A
V
L
I
M
P
F
W
Gruppo R polare carico
Lisina
Arginina
Istidina
Acido Aspartico
Acido Glutammico
Lys
Arg
His
Asp
Glu
Gruppo R polare non carico
Serina
Ser
S
TreoninaThr
T
Asparagina
Asn
N
Glutammina
Gln
Q
Tirosina
Tyr
Y
Cisteina
Cys
C
K
R
H
D
E
Le catene laterali degli aminoacidi
Esistono alcune regole per ricordare facilmente il codice ad una lettera degli
aminoacidi.
- se solo un aminoacido comincia con una determinata lettera, allora si usa
quella lettera:
C = Cys = Cysteine
H = His = Histidine
I = Ile = Isoleucine
M = Met = Methionine
S = Ser = Serine
V = Val = Valine
- se ppiù di un aminoacido comincia p
per una determinata lettera,, q
quella lettera
viene assegnata all’aminoacido più ricorrente:
A = Ala = Alanine
G = Gly
Gl = Glycine
Gl i
L = Leu = Leucine
P = Pro = Proline
T = Thr
Th = Threonine
Th
i
Le catene laterali degli aminoacidi
- alcuni sono evocativi della fonetica:
F = Phe = Phenylalanine (Fenylalanine)
R = Arg = Arginine (aRginine)
Y = Tyr = Tyrosine (tYrosine)
W = Trp = Tryprophan (doppio anello nella molecola)
D = Asp = Aspartic acid (asparDic acid)
- altri casi:
N = Asn = Asparagine
p g ((AsparagiNe)
p g )
E = Glu = Glutamic acid (da ‘gluE’)
Q = Gln = Glutamine (Q-tamine)
K = Lysine (K viene prima di L nell’alfabeto)
Macromolecole Biologiche
Gruppo R non polare
Glicina
E’ stato il primo aminoacido ad essere identificato
nelle proteine idrolizzate, nel 1820. E’ l’aminoacido
ppiù semplice,
p , con la catena laterale p
più p
piccola,,
formata soltanto da un atomo H.
La presenza del solo atomo H come catena laterale fa
sì che:
- il Cα non sia asimmetrico, per cui non si può
distinguere tra forma L e D. La glicina, quindi, è
l’ i aminoacido
l’unico
i
id a non essere otticamente
tti
t attivo.
tti
- la catena principale della glicina abbia la massima
flessibilità conformazionale.
conformazionale
Macromolecole Biologiche
Gruppo R non polare
Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina
Presentano catene laterali alifatiche di diverse
dimensioni, costituite da gruppi inerti metilene
((–CH2–)) e metile ((–CH3)).
In particolare, la catena laterale dell’isoleucina
presenta un secondo centro chirale (atomo di Cβ
asimmetrico), per cui in teoria sono possibili
22 = 4 stereoisomeri per l’isoleucina. In realtà, la
catena laterale dell’isoleucina isolata nelle
proteine e’ sempre di tipo L.
Gruppo R non polare
Metionina
La sua catena laterale presenta un gruppo tioetere (R–S–R) che ricorda un
gruppo n-butile in molte delle sue proprietà fisiche quali volume,
volume
conformazione, polarità (gli atomi C e S hanno elettronegatività quasi
uguale ed S è circa delle dimensioni di un gruppo metilene –CH2). S e’
nucleofilo. Puo essere ossidato a solfossido e a solfone. E’ il p
punto di
attacco per Br-CN, nella frammentazione delle proteine.
Gruppo R non polare
Prolina
Il gruppo alifatico che costituisce la catena laterale della prolina è legato
covalentemente all’atomo N della catena principale, a formare un anello
pirrolidinico
i lidi i (caratteristica
(
tt i ti unica
i fra
f i 20 aminoacidi).
i
idi)
La struttura ciclica della catena laterale della prolina impone rigidi vincoli
conformazionali sulla catena principale (la rotazione intorno al legame N–Cα è
bloccata a circa -60
60°)). Il 10 % delle proline nelle proteine adotta un legame
peptidico in conformazione cis.
Il ΔG tra le forme cis e trans della Pro
e’ 8.3 kJ/mol. L’energia di attivazione per
l’isomerizzazione cis/trans di Pro e’ di
54.3 kJ/mol, contro 83 kJ/mol degli
altri aminoacidi.
Gruppo R non polare
Fenilalanina e Triptofano
La fenilalanina e il triptofano sono aminoacidi
aromatici, in quanto la loro catena laterale contiene
un anello aromatico chimicamente paragonabile a
quello del benzene.
In particolare, la catena laterale del triptofano,
costituita
tit it da
d un gruppo indolico,
i d li
è la
l più
iù grande
d e
voluminosa di tutti i 20 aminoacidi.
La ppresenza di un anello aromatico conferisce a tali
aminoacidi la proprietà di assorbire la radiazione
elettromagnetica nella banda dell’ultravioletto e
quindi di essere un’utile sonda fluorescente per
studiare la struttura delle proteine nelle zone ad
essi circostanti.
Gruppo R non polare
Fenilalanina e Triptofano
Nessuno degli aminoacidi assorbe la luce
nella banda del visibile,
visibile alcuni aminoacidi
assorbono la radiazione nella banda
dell’ultravioletto e tutti assorbono nella
banda dell’infrarosso.
Solo gli aminoacidi aromatici Phe, Tyr e
Trp hanno un significativo assorbimento
nell’ultravioletto
ll’ lt i l tt all di sopra di λ = 250 nm.
Emettono in fluorescenza tra 282 e 348 nm.
I coefficienti di estinzione molare misurati
a 280 nm sono (M-1 cm-1):
Phe
Tyr
Trp
195
1420
5600
Gruppo R polare non carico
Serina e Treonina
Le catene laterali di serina e treonina presentano un gruppo idrossilico
((R–OH)) di dimensioni diverse.
In particolare, anche la catena laterale della treonina presenta un secondo
centro chirale (atomo di Cβ asimmetrico). Discorso analogo alla catena
laterale dell’isoleucina.
Gruppo R polare non carico
Asparagina e Glutammina
Asparagina e glutammina sono la forma ammidica rispettivamente di acido
aspartico e acido glutammico. Non sono, però, il prodotto dell’amidazione
dei due acidi, ma ricorrono in natura e sono incorporati direttamente nelle
proteine.
Gruppo R polare non carico
Tirosina
La catena laterale della tirosina presenta un gruppo
fenolico (anello aromatico
aromatico–OH)
OH), responsabile,
responsabile
insieme agli anelli aromatici di Phe e Trp,
dell’assorbimento
nell’ultravioletto
e
della
fluorescenza delle p
proteine che contengono
g
questi
q
aminoacidi.
Cisteina
La catena laterale della cisteina contiene un gruppo
tiolo (R–SH), estremamente reattivo. Due cisteine che
si trovano in posizioni diverse della catena
polipeptidica,
li
idi
ma
adiacenti
di
i
nella
ll
struttura
tridimensionale di una proteina possono essere
ossidate e formare un ponte disolfuro.
Ponte disolfuro
Il ponte disolfuro è di solito il prodotto finale dell’ossidazione da parte di O2
atmosferico, secondo il seguente schema di reazione:
Ponte disolfuro
Questa reazione richiede un ambiente ossidativo e quindi i ponti disolfuro non
ricorrono normalmente in proteine intracellulari, che si trovano in un ambiente
principalmente
p
p
riducente. I p
ponti disolfuro sono invece frequenti
q
nelle p
proteine
extracellulari secrete dalle cellule e negli eucarioti.
I ponti disolfuro stabilizzano la struttura tridimensionale delle proteine:
possono formarsi fra cisteine appartenenti a due catene polipeptidiche diverse
(come per esempio tra la catena A e la catena B dell’insulina), oppure possono
essere intramolecolari, rendendo così la proteina meno soggetta a degradazione.
I ponti disolfuro sono legami covalenti, che possono essere rotti introducendo
un agente riducente, come per esempio β-mercaptoetanolo o ditiotreitolo
(DTT).
(DTT)
Gruppo R polare carico
Lisina, Arginina e Istidina
Sono tre aminoacidi basici, carichi positivamente a pH fisiologico.
La catena laterale della lisina p
presenta un g
gruppo
pp butilammonio,, q
quella
dell’arginina un gruppo propilguanidinico e quella dell’istidina un gruppo
imidazolico.
Gruppo R polare carico
L’istidina, in particolare, ha un pKR = 6.3-6.8 e ionizza entro l’intervallo di
pH fisiologico (attorno a 7.2). A pH = 6.4, il suo gruppo imidazolico è carico
ppositivamente solo al 50 %;; a p
pH = 7.4 la catena laterale dell’istidina è
elettrostaticamente carica solo al 10 %, tendendo alla neutralità all’estremità
basica dell’intervallo del pH fisiologico. Conseguenza di tale proprietà è che
le catene laterali dell’istidina spesso sono coinvolte nelle reazioni catalitiche
degli enzimi che richiedono scambio di ioni H+.
Gruppo R polare carico
Acido aspartico e Acido glutammico
Sono due aminoacidi acidi, carichi negativamente sopra pH = 4 (gruppo
COO-). Essi differiscono uno dall’altro solo nell’avere rispettivamente uno o
due gruppi metilene.
La piccola differenza in lunghezza della loro catena laterale fa sì che
abbiano una reattività chimica sensibilmente diversa.
Q d sii trovano
Quando
t
nell loro
l
stato
t t ionizzato,
i i t cii sii riferisce
if i
ad
d essii come
aspartato e glutammato.
http://www.wiley.com/legacy/college/boyer/0470003790/animations/animations.htm
Aminoacidi ‘non standard’
I 20 aminoacidi ‘standard’
standard non sono gli unici aminoacidi che si trovano nei
sistemi biologici. Esistono anche gli aminoacidi ‘non standard’, che talvolta
sono importanti costituenti delle proteine.
Gli aminoacidi ‘non standard’ risultano da specifiche modificazioni degli
aminoacidi ‘standard’ dopo la sintesi della catena polipeptidica (modificazioni
post-traslazionali).
In molti casi queste modificazioni sono importanti, se non essenziali, per la
funzione della proteina.
Spesso sono modificati
S
difi ti anche
h aminoacidi
i
idi di proteine
t i che
h formano
f
complessi
l i
con acidi nucleici: per esempio proteine ribosomiali e cromosomiali (istoni)
possono essere metilate, acetilate, e/o fosforilate.
Aminoacidi ‘non standard’
Fra gli aminoacidi modificati più importanti si hanno la 4
4-idrossiprolina
idrossiprolina
e la 5-idrossilisina, spesso trovati come costituenti della proteina fibrosa
collagene.
Aminoacidi ‘non standard’
N formilmetionina è il residuo N
N-formilmetionina
N-terminale
terminale
di tutte le proteine procariotiche; di solito
viene rimossa durante il processo di
maturazione della proteina.
p
L’acido γ-carbossiglutammico è il
costituente di varie proteine coinvolte
nella
ll coagulazione
l i
d l sangue.
del
Gli aminoacidi di tipo D
Gli aminoacidi di tipo D sono pochissimo rappresentati in Natura.
Natura Essi sono
componenti specifici di peptidi batterici (lunghi meno di 20 residui) sintetizzati
enzimaticamente piuttosto che tramite i ribosomi.
Questi polipeptidi sono importanti costituenti che conferiscono resistenza alle
pareti cellulari batteriche, perché gli aminoacidi di tipo D subiscono meno
facilmente l’attacco di peptidasi che comunemente degradano le strutture
polipeptidiche costituite da aminoacidi di tipo L.
Inoltre, gli aminoacidi di tipo D sono i componenti di antibiotici prodotti dai
b tt i come valinomicina,
batteri,
li
i i gramicidina
i idi A e actinomicina
ti
i i D.
D
Derivati degli aminoacidi
Gli aminoacidi e i loro derivati svolgono funzioni biologiche molto importanti,
oltre ad essere i costituenti delle proteine:
- intermedi in vari processi metabolici:
citrullina e ornitina sono intermedi
i
di nell ciclo
i l dell’urea;
d ll
omocisteina è un intermedio nel metabolismo degli aminoacidi;
S-adenosilmetionina è una molecola in grado di trasferire gruppi metilici.
Derivati degli aminoacidi
- messaggeri chimici nella comunicazione fra le cellule:
glicina, acido γ-aminobutirrico (GABA; prodotto della decarbossilazione del
glutammato) e dopamina (derivato della tirosina) sono neurotrasmettitori;
(prodotto della decarbossilazione dell’istidina)) è un p
potente
istamina (p
mediatore locale delle reazioni allergiche;
tiroxina (derivato della tirosina) è un ormone della tiroide, contenente iodio,
che generalmente stimola il metabolismo nei vertebrati.
Test yourself
• http://www
http://www.wiley.com//legacy/wileychi/whitf
wiley com//legacy/wileychi/whitf
ordproteins/supp/MCQ/c02_quiz.htm
• http://www.wiley.com/legacy/wileychi/whitf
http://www wiley com/legacy/wileychi/whitf
ordproteins/supp/MCQ/c03_quiz.htm