Lezione 10
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CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Docente: Adriana Maggi AA 2011/2012 Lezione 10 Valeria Benedusi Biological reporter: molecules acting as surrogate, measurable, indicators of a given molecular event Geni reporter I sistemi reporter sono utilizzati per lo studio di regioni promotore o enhancer e della loro interazione con elementi trans-regolatori L’attività di un promotore e il ruolo funzionale degli elementi di controllo ivi presenti è valutata clonando questa regione a monte del gene reporter, contenuto solitamente in un plasmide di espressione. I plasmidi ricombinanti vengono poi introdotti in opportune linee cellulari in cui si va poi a quantificare la concentrazione della proteina reporter prodotta o della sua attività enzimatica Geni reporter I geni reporter codificano per una specifica attività enzimatica che risponde a diverse caratteristiche: •deve essere assente nella specie in esame e facilmente distinguibile da ogni attività enzimatica simile presente nella cellula; •non deve presentare competizione o interferenza con altre attività enzimatiche cellulari; •il saggio deve essere semplice, rapido, sensibile e riproducibile. In saggi in cellule eucariotiche i geni reporter più usati sono quelli codificanti per enzimi batterici: CAT ( cloramfenicolo acetil transferasi) β-galattosidasi GUS (β-glucuronidasi) LUC (Luciferasi) GFP (green fluorescent protein) Lo studio della regolazione dell’espressione genica. I sistemi reporter X Elementi di regolazione trans Y Promotore Proteina facilmente dosabile Z Gene reporter Elementi di regolazione cis Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione. Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter. Questo principio può essere esteso agli animali transgenici Saggio reporter ER ER ERE (Estrogen Responsive Element) Screening di molecole farmacologicamente attive. ER cDNA LUC Potenziali ligandi ER ER LUC LUC Units ERE CTR E2 CTR I geni reporter GENE VANTAGGI B-Galattosidasi Ben caratterizzata, stabile, (Batterica) rilevazione automatizzabile Luciferasi (Lucciola) Fosfatasi alcalina (Umana) Alta attività specifica, mancanza di attività endogena (basso background) Proteina di secrezione, saggio colorimetrico molto sensibile. fluorescent proteins (GFP, varianti RFP, BFP) Monomerico, non richiede substrato, assente nei mammiferi, varianti con diversa l di fluorescenza. SVANTAGGI Presenza di attività endogena in cellule di mammifero, enzima tetramerico (risposta non lineare) Richiede l’aggiunta di cofattore, O2, ATP. Elevata attività endogena in alcuni tipi cellulari. Bassa sensibilità per mancanza di amplificazione (non è una reazione enzimatica) Fluorescent proteins La Green Fluorescent Protein (GFP) è una proteina naturale (prodotta dalla medusa Aequorea victoria) di piccole dimensioni (238 aa 26,9 kd) che se eccitata da una radiazione nel campo dell’ultravioletto (l 395 nm), ma anche del visibile (l 475 nm, colore blu) emette una radiazione di colore verde (505 nm) Osamu Shimomura Premio Nobel 2008 Il fluoroforo di GFP è un tripepide Ser-deidroTyr-Gly che è ciclizzato: p-idrossibenzilideneimidazolidone Nella struttura tridimensionale della GFP alcuni residui basici fanno ponti a idrogeno con atomi di ossigeno (His148 con Tyr66 e Gln94 o Arg96 con l’ imidazolidone.) stabilizzando il fluoroforo L’emissione di luce avviene tramite un meccanismo sequenziale di un processo autocatalitico in assenza di cofattori. La reazione inizia con una rapida ciclizzazione tra la Ser65 e la Gly67 per formare un prodotto intermedio (imidazolin-5-one) seguita da una reazione di ossidazione della Tyr66. La reazione è termosensibile, ma una volta prodotta la GFP è molto stabile. La proteina è stata cristallizzata e la sua struttura determinata. La GFP funziona in forma dimerica la struttura cilindrica è sostenuta da foglietti beta, le dimensioni del cilindro sono 30 Å di larghezza e 40 Å di lunghezza , segmenti ad alfa elica chiudono i cilindri da ambedue le parti e costituiscono lo scheletro per la formazione del fluoroforo che si trova al centro dei cilindri. Questa particolare struttura con foglietti beta esterni e alfa eliche interne forma una nuova classe di proteine denominata beta-can. Si tratta di una struttura molto stabile e difficilmente degradabile. La conoscenza della struttura ha permesso di generare una serie di mutanti, il primo dei quali è stata una muazione puntiforme (S65T) descritta da Roger Tsien nel 1995 che migliora le caratteristiche dello spettro di emissione (509 nm) con una fluorescenza più sostenuta e più stabile nel tempo e lo spostamento del picco di eccitazione a 488 nm. Negli anni a seguire, il gruppo di Tsien ha sviluppato una vastissima gamma di proteine fluorescenti (YFP, EBFP, EBFP2, citrine, Venus, ecc) Roger Tsien, premio Nobel 2008 Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP). Citosol BFP Golgi GFP Luciferasi Le luciferasi sono una classe di enzimi ossidativi che agendo su un substrato specifico causano la produzione di fotoni ( luciferasi di lucciola, e suoi derivati ricombinanti, Luc 2, ecc) ' (lucem ferre). luciferina + ATP → luciferil adenilato + PPi luciferil adenylato + O2 → ossiluciferina + AMP + fotoni Utilizzo di proteine bioluminescenti o fluorescenti per studi di funzione geniche, di correlazioni-struttura-funzione, di regolazione di espressione genica Effetto di mutazioni specifiche sulla attività trascrizionale del recettore degli estrogeni NH2- A AF-1 DBD NH2- A AF-1 DBD DBD ER activity (fold over basal) 4 3 D AF-2 F -COOH :wt :1-399 D AF-2 F -COOH :182-599 NH2- A AF-1 DBD D AF-2 F -COOH :S122-A NH2- A AF-1 DBD D AF-2 F -COOH :C241/244-A NH2- A AF-1 DBD D AF-2 F -COOH :G525-R NH2- A AF-1 DBD D AF-2 F -COOH :L543/544-A 2 1 * 0 aa 1 mM ** ** ** Un esempio storico. L’analisi del promotore del gene tk del virus Herpes simplex -100 GC -80 CCAAT -60 GC -40 -20 TATA +1 + + + + - Generazione di mutanti + + --+-+- Trascrizione in oociti di Xenopus laevis Analisi di Northern Studio di funzione genica: l’esempio della identificazione della funzione di Nip-2 e protimosina Prothymosin alpha (PTMA) • • • • highly acidic polypeptide of 12,6 kDa highly conserved among species widely distributed among tissues nuclear localization involved in: • cell cycle progression • cell growth and proliferation bnip-2 expression associates to cell death 16 h 24h 48h 20 15 c nip 0.5 nip 1.5 nip 2.5 nip2 mRNA Cell death (dead cells/dish)x 10 2 7 6 5 4 3 2 1 0 10 5 0 • Nip-2 pro-apoptotic activity is blocked by overexpression of Bcl-2 • mutants of nip-2 in the Bcl-2 binding domain fail to cause apoptosis Meda et al. 2001 0 1 4 16 24 48 Hours after Locke TRANSFEZIONE DI bnip2/PROT-A cDNA IN MCF-7 CELLS BNIP2 %survival apoptosi 100 PTMA CTRL 50 25 0 % proliferation proliferazione CTRL 75 CTRL BNIP2 200 150 100 50 0 CTRL PTMA STUDI DI STRUTTURAFUNZIONE Greene et al. EMBO reports 8, 6, 563–568 (2007) Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Analisi struttura funzione delle proteine eucariote RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci High-throughput Screening (1) La possibilità di automatizzare la detezione del reporter consente uno screening ad “alto flusso”. Library di molecole Saggio biologico Piattaforma automatizzabile Robotizzata Elaborazione digitale dei dati High-throughput Screening (2) 1990. 20 ricercatori 1.5 milioni di molecole/anno Oggi. 4 ricercatori 2.5 milioni di molecole/anno I più moderni saggi di screening consentono la determinazione della POTENZA e della SPECIFICITA’ della sostanza testata. Applicazioni dell’ingegneria cellulare. Analisi struttura funzione delle proteine eucariote RICERCA DI BASE APPLICAZIONI INDUSTRIALI Riconoscimento della funzione di una proteina (oncogeni, geni oncosoppressori) Studio della regolazione dell’espressione genica. Analisi di mutazioni di elementi cis e trans Screening di molecole farmacologicamente attive (HTS) Produzione di biofarmaci INGEGNERIA CELLULARE TRASFEZIONE TRANSIENTE STABILE Kin RANDOM INTEGRATION • GENE FUNCTION (scelta vettore; promotore; costrutto) • SCREENING FARMACI • STUDI STRUTTURAFUNZIONE • PRODUZIONE PROTEINE • GENE FUNCTION PRODUZIONE DI PROTEINE PER MEZZO DELL’ INGEGNERIA GENETICA A cosa possono servire le proteine ricombinanti? -proteine di interesse terapeutico. -proteine di interesse commerciale (enzimi). -proteine da utilizzare come antigeni per la produzione di anticorpi policlonali e monoclonali. -reagenti per la ricerca di base e applicata. Produzione di biofarmaci La produzione delle proteine terapeutiche in microorganismi non è sempre possibile soprattutto per le modificazioni post-traduzionali L’utilizzo di cellule animali consente di ottenere prodotti proteici strutturalmente più simili al fisiologico, ma pone serie difficoltà tecniche e costi più elevati. MANIPOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA IN CELLULE EUCARIOTICHE Vantaggi rispetto a sistemi procariotici -formazione corretta di ponti disolfuro -folding corretto -taglio proteolitico da precursore -glicosilazione -modificazione di aa (fosforilazione, acetilazione, miristilazione, ecc.) PROGRAMMAZIONE DI UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA CELLULARE • SCELTA DEL SISTEMA CELLULARE • DISEGNO DEL VETTORE DI ESPRESSIONE • MODIFICAZIONE DEL SISTEMA CELLULARE • CLONAGGIO CELLULE CON ALTA ESPRESSIONE, STABILITA’, SENSIBILITA’ A OSMOLARITA’ E pCO2 • OTTIMIZZAZIONE DEL MEZZO DI COLTURA • SCALING UP (DA 3 A 10000 L) TPA (tissue plasminogen activator) ricombinante Il primo farmaco ricombinante prodotto in cellule di mammifero Cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) Pregressa conoscenza nella produzione di vaccini Assenza di attività tossica per l’uomo Stabile integrazione di geni eterologhi Crescita in sospensione o monostrato Modificazioni post-traduzionali corrette REATTORE PER CRESCITA DI CELLULE EUCARIOTE Moreira Biopharm Int. 2007 CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO ROLLER BOTTLES CELL CUBES CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO CELL FACTORY CRESCITA DI CELLULE IN MONOSTRATO MICROCARRIER IN VASCHE AGITANTI IMPIANTO DI FERMENTAZIONE PER LA PRODUZIONE DI PROTEINE TERAPEUTICHE Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA’ Controllo di qualità di proteine terapeutiche Caratterizzazione della proteina Determinazione dello stato di purezza Saggio biologico SDS PAGE/Western Saggio immunologico HPLC SDS PAGE Western Presenza di proteine seriche Isoelectrofocusing Presenza di proteine cellulari HPLC Presenza pirogeni Mappa peptidica Presenza di DNA cellulare Sequenziamento N-terminale Spettrometria di massa Composizione in carboidrati Composizione in acido sialico Difficoltà nella produzione di biofarmaci Istituzione di Master cell banks caratterizzate in dettaglio per stabilità genetica, tempi di crescita, contaminazioni, numero di copie del vettore, livello di espressione del transgene. Preparazione di Manufacturers cell banks sottoposte ad ulteriore caratterizzazione prima e dopo il caricamento nell’impianto pilota Controllo su larga scala della stabilità nelle condizioni di fermentazione, con la preparazione di Extended cell banks. Controllo delle condizioni di produzione Recupero e produzione Caratterizzazione del prodotto CONTROLLO QUALITA’
