Lezione 6 2009-10

Adriana Maggi
METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI
EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI
L’IMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI
STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN
CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI
CON L’APPLICAZIONE DI SISTEMI
REPORTER
SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE
VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE
RIPRODUCONO FEDELMENTE L’EVENTO
MOLECOLARE IN STUDIO
Tra i reporter più utilizzati: cloramfenicolo
acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta
Atr i reporter
più uilizzati:
galattosidasi,
beta-glucuronidasi,
luciferasi,
proteina verde fluorescente
β-galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal
trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a
5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu
β-glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su
substrati incolori quali:
5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di
colore blu
4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto
fluorescente
Cloramfenicolo acetiltransferasi:
un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetilCOA (radioattivo) al cloramfenicolo
GENE
ADVANTAGES
DISADVANTAGES
BGalattosidase
(Bacateria)
Well characterized,
stable, low cost substrate,
detectable by automtized
systems
Presence of endogenous
activity in mammalian cells,
tetrameric enzymes- non
linear response
Luciferase
(insect)
High specific activity,
very low background)
Detection needs the
cofactor O2, ATP.
Substrate quite expensive
Fosfatase
(human)
Secreted protein,
enzymatic assay
extremely sensitive.
Very high background in
selected cell types
Green
fluorescent
protein (GFP,
and variants
RFP, BFP)
Monomeric, no substrate
Low sensitivity in the
required, not expressed in absence of enhancer (this is
mammalian, variants with
not an enzymatic reaction)
different l of emission
Reporter bioluminescenti e fluorescenti
Tipiche molecole reporter per imaging sono:
Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others), proteine
strutturalmente omologhe contenenti sequenze di tre
aa in grado di funzionare da cromoforo
Molecole bioluminescenti (fotoproteine e luciferasi)
proteine che diventano/emettono particelle luminose in
prsenza di specifici cofattori o substrati
Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria)
Una proteina composta da 238 aa la cui struttura
spaziale determina la formazione di una struttura a forma
di “lattina di birra” al cui interno risiede il cromoforo (un
tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ).
L’emissione è a l= 504 nm)
Natural Fluorescent proteins
Anemonia sulcata "kindling"
fluorescent protein
Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red
fluorescent protein chromophore
Synthetic Fluorescent proteins
La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi:
luciferin + ATP → luciferyl adenylate + Ppi
luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + light
Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento
conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con
conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione
di Co2 e bioluminescenza
I sistemi reporter nello studio della regolazione
dell’espressione genica
X
Elementi di
regolazione
trans
Proteina facilmente
dosabile
Z
Y
Promotore
Gene reporter
Elementi di regolazione cis
Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di
regolazione della trascrizione.
Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire
con l’espressione del gene reporter.
Questo principio può essere esteso agli animali transgenici
Identificazione di molecole attive su fattori di
trascrizione.
ER cDNA
LUC
Potenziali
ligandi
ER ER
LUC
LUC Units
ERE
CTR
E2
CTR
I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di
trasduttori del segnale
I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine
GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER
Ingegneria Cellulare
Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante
mutazioni del genoma stesso o mediante l’inserimento
di DNA esogeno
La scelta del sistema cellulare
• coltura primaria
• cellula immortalizzata
• linea tumorale
Transfezioni stabili o transienti
Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene
trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della
cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi
Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma
della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva
viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.
La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul
totale delle cellule transfettate
Scelta della tecnica di transfezione
Microiniezione
Adsorbimento mediante DEAE-Destrano
Coprecipitazione con calcio fosfato
Lipofezione
Elettroporazione
Infezione con vettori virali
Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi
reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP).
Citosol BFP
Golgi GFP