Fermentazione alcolica File - Progetto e

BIOCHIMICA DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA
LA FERMENTAZIONE ALCOLICA è un processo complesso in cui oltre alla
trasformazione degli zuccheri (glucosio e fruttosio) in etanolo e anidride carbonica
altri processi biochimici, chimici e fisico-chimici intervengono per trasformare il
succo d’uva in vino.
PRODUZIONE DI ALTRI COMPOSTI: Alcoli superiori, esteri, glicerolo, acido
succinnico, diacetil, acetoina e 2,3-butandiolo.
Diversi LIEVITI partecipano al processo di fermentazione, il Saccharomyces cerevisiae
predomina per la sua elevata resistenza ad elevate conc di etanolo. La presenza anche di
altre specie di lievito nel vino stesso può causare difetti organolettici; e determinare la
composizione finale in maniera positiva o negativa a seconda del tipo di lievito cresciuto
RIMEDIO: Aggiunta di biossido di zolfo e inoculazione di ceppi selezionati di lieviti secchi
CICLO DI CRESCITA DEI LIEVITI
 Se non vengono inoculati lieviti la popolazione iniziale è circa 104 cellule/mL
 Dopo inoculazione è circa 5 x 106 cellule/mL
 La fase esponenziale di crescita (107-108 cellule/mL per 3-6gg) è influenzata dalla
T, da nutrienti (come ammoniaca, aa ) e dalla presenza di O2
 La fase quasi-stazionaria in cui la pop. di lieviti rimane stabile può durare da 2 a
10gg
 Durante la fase di declino i lieviti muoiono per mancanza di nutrienti e perché
l’etanolo e altre sostanze prodotte durante la ferm alcol. sono tossiche per loro
Il successo di una fermentazione alcolica dipende dal mantenere la popolazione
di lieviti vitali a livelli sufficienti finché tutti gli zuccheri fermentabili sono stati
pienamente consumati per evitare problemi di lenta fermentazione
MECCANISMO BIOCHIMICO DELLA GLICOLISI
FERMENTAZIONE E RESPIRAZIONE
I lieviti (microorganismi anaerobi
facoltativi) possono consumare zuccheri
utilizzando due differenti pathways
metabolici:
RESPIRAZIONE E FERMENTAZIONE
36-38 molecole di ATP
2molecole di ATP
La respirazione è un processo più
vantaggioso per i lieviti in termini di
energia ma necessita di ossigeno ed è
inibito da alte conc di zuccheri
FERMENTAZIONE ALCOLICA
 Quando il succo d’uva inizia a
fermentare, Saccharomyces
cerevisiae indirizza il piruvato a
produrre etanolo allo scopo di
rigenerare il NAD+ consumato
dalla glicolisi
 Presenti tre isoenzimi dell’alcool
deidrogenasi nei Saccharomyces
cerevisiae, ma l’isoenzima I è
quello responsabile della
conversione di etanale in
etanolo; l’alcool deidrogenasi
utilizza zinco come cofattore
 Entrambi i prodotti finali della
fermentazione, etanolo e CO2,
sono trasportati fuori dalla
cellula per diffusione semplice
Reazione catalizzata dall’alcol deidrogenasi
FERMENTAZIONE GLICEROPIRUVICA
 Genera glicerolo come prodotto finale
 La fermentazione di glucosio in presenza di
solfiti produce elevati livelli di glicerolo: i
solfiti si legano a l’etanale prevenendo la
rigenerazione di NAD+ via alcool
deidrogenasi per cui il pathway alternativo
della fermentazione gliceropiruvica è
necessario per compensare il deficit di NAD+
 La produzione di glicerolo consuma ATP
necessaria per compensare lo squilibrio
redox della cellula
 Si attiva nelle prime fasi di ferm. quando i
lieviti sono nella fase esponenziale di crescita
ed hanno bisogno di piruvato per aumentare
la loro biomassa
 I lieviti producono glicerolo come protettore
contro alte pressioni osmotiche
 Il Glicerolo è il terzo componente del vino
(dopo l’etanolo e l’acqua) conc 6-10 g/L e
conferisce sensazioni dolci al palato
METABOLISMO DELL’AZOTO
 I lieviti hanno bisogno di azoto per
sintetizzare la biomassa
 Azoto facilmente assimilabile (EAN):
ammoniaca ed amminoacidi (ad eccezione
della prolina)
 Succo d’uva povero di ammoniaca e
amminoacidi per cui si aggiungono Sali
d’ammonio
 Conc di EAN più basse di 130 mg/L
influenzano il corretto sviluppo della
fermentazione alcolica
 Conc elevate di azoto portano alla presenza
di residui di azoto non assimilabile nel vino
che è un fattore di instabilità microbiologica
e può favorire la produzione di etil
carbammato e amine biogene
• Gli aa possono essere direttamente usati per sintetizzare proteine
• La perdita di EAN porterebbe i lieviti ad usare aa sulfidrici (cisteina e
metionina)rilasciando solfiti e mercaptano che determinano cattivi odori
OSSIGENO E BIOSINTESI LIPIDI
Durante la fase di crescita, mentre la moltiplicazione cellulare è attiva, i
lieviti hanno bisogno di costruire nuove membrane plasmatiche
 I lieviti devono sintetizzare grandi quantità di steroli, acidi grassi e fosfolipidi
durante le prime fasi della fermentazione alcoolica
 Gli steroli sono sintetizzati attraverso il pathway del mevalonato:
Reazioni chiave
- trasformazione dello squalene in squalene 2,3 eposside con ossigeno come
substrato
- Produzione di ergosterolo il principale sterolo in Saccharomyces cerevisiae
 In assenza di O2 il pathway è bloccato
SINTESI DI ERGOSTEROLO NEI LIEVITI
SINTESI DI ACIDI GRASSI NEI LIEVITI
Complesso multienzimatico: SINTETASI
DEGLI ACIDI GRASSI
 Produzione di acido palmitico da cui
vengono sintetizzati altri ac. Grassi
(SFA)
 Ac. Grassi non saturi (UFA) avviene in
presenza di O2 da parte dell’enzima OLE1
attivato da basse T
 Ac. Grassi usati per sintetizzare
fosfolipidi che vengono inseriti nelle
membrane plasmatiche
L’Aerazione del succo d’uva è raccomandata
durante la fase esponenziale di crescita allo
scopo di sostenere i lieviti a costruire le loro
membrane ed evitare problemi di
fermentazione
FLUIDITA’ DELLA MEMBRANA
 ECCESSIVA RIGIDIDITA’ previene il corretto funzionamento dei sistemi di trasporto
cellulare
 ECCESSIVA FLUIDITA’ altera l’organizzazione e le proprietà dinamiche del doppio
strato fosfolipidico
 T e CONC ETANOLO influenzano la fluidità di membrana
- nella preparazione del vino bianco i lieviti Saccharomyces cerevisiae si
sviluppano a basse T che riducono la fluidità di membrana; per
mantenere un’adeguata fluidità i lieviti aumentano la proporzione di UFA nei
fosfolipidi (maggiore fluidità)
- nella preparazione del vino rosso la fermentazione avviene ad alte T (2830 °C) e in condizioni aerate per aumentare l’estrazione del colore
 Sotto normali condizioni di fermentazione del bianco il succo d’uva è povero di ac.
grassi e la ferm. avviene in condizioni ipossiche per cui la fluidità di membrana viene
ottenuta incorporando acidi grassi a catena media (MCFA) nei fosfolipidi di
membrana (l’effetto di una corta catena è simile a quello del doppio legame di una
catena pesante)
 L’etanolo altera la fluidità di membrana per cui i Saccharomyces cerevisiae
aumentano la lo proporzione di steroli e UFA per compensare tale effetto (possibile
durante la produzione del vino rosso che avviene in condizioni di aerazione mentre in
quella del bianco l’assenza di O2 rende difficile ai lieviti l’adattamento all’etanolo)
PROBLEMI DELLA FERMENTAZIONE
 ELEVATA CONC DI ZUCCHERI inibisce i lieviti. Negli ultimi stadi della ferm.
una elevata conc di etanolo può alterare il pieno consumo di zuccheri.
Rimedio: usare lieviti con alta resistenza all’etanolo
 T ESTREME: troppo bassa problemi di crescita dei lieviti; troppo alta (> 30°C)
rischio di blocco della ferm. Variazioni brusche comportano rigidità della
membrana. Indispensabile controllo termico della ferm.
 ANAEROBIOSI COMPLETA: ossigeno necessario per sintetizzare ergosterolo
e MCFA. L’aerazione è raccomandata durante la fase esponenziale di crescita.
 CARENZA DI NUTRIENTI attivatori di lieviti (Sali di ammonio) aggiunti ad
inizio/fase stazionaria/fine della ferm.
 PRESENZA DI SOSTANZE ANTIFUNGINE
 PRESENZA DI MCFA può diminuire la vitalità dei lieviti e fermare la ferm. Le
scorze di lievito vengono aggiunte per evitare tale problema in quanto
assorbono i MCFA e forniscono steroli e UFA ai lieviti
 ANTAGONISMO TRA MICROORGANISMI che competono per i nutrienti
(Sacc. Cerevisae, lieviti autoctoni e batteri)
RISOLUZIONE PROBLEMI: abbondante aerazione e scorze di lievito, se la
fermentazione si ferma il lievito deve essere rinoculato
SOTTOPRODOTTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA
1. DIACETILE, ACETOINA E 2,3-BUTANEDIOLO: il piruvato si trasforma in
acetolactato che a seguito della decarb. ox forma diacetile o acetoina nel caso
di decarb. non ox. Acetoina poi ridotta a 2,3-butandiolo (reaz. reversibile).
Acetoina e diacetile sono responsabile dell’aroma di burro.
2. ETANALE (ACETALDEIDE) intermedio della ferm, deriva dalla decarb. del
piruvato, ridotto poi ad etanolo anche se parte di esso viene rilasciato nel
vino.
3. ACIDO ACETICO principale ac volatile del vino. Odore di aceto e
sensazione sgradevole al palato. Quantità normalmente prodotta dai lieviti
0,1-0,3 g/l, un’elevata produzione di ac. acetico (prodotta anche da batteri
acetici) può essere dovuta allo sviluppo di patologie lattiche o perché i lieviti
ne producono di più rispetto a quello derivante dall’idrolisi di Acetil CoA.
4. ALCOOL SUPERIORI prodotti dalla deviazione del metabolismo di aa,
prodotti quando i chetoacidi sono decarbossilati e ridotti; conferiscono
proprietà sensoriali.
5. ESTERI sintetizzati da acil-CoA e alcoli da parte di enzimi alcol-acilCoA
transferasi. Ne sono di due tipi: acetati degli alcool sup (odore di rosa,
banana ecc) e gli esteri degli ac grassi ed etanolo (aroma fruttata)
6. ACIDO ASUCCINNICO terzo prodotto della ferm in conc 0,6-1,2 g/l,
derivante secondo alcuni autori dal ciclo di Krebs. Contribuisce all’acidità
del vino.