E 3O 2 ordine di legame lunghezza del legame (pm) E 2O2.- 1O22- 2 1,5 1 121 128 149 1O2 1O2 3O2 Reattività e tossicità dell’ossigeno e dei suoi derivati Attivazione riduttiva 1O energia 2 Reagisce velocemente con substrati organici che sono tutti nello stato fondamentale di singoletto e3O 2 2 O2 -. + 2H+ Reagisce velocemente con radicali organici (che hanno elettroni spaiati) e con complessi di metalli di transizione paramagnetici e-, 2H+ 2O -. 2 H2O2 H2O2 + O2 Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH- + OH. La tossicità dell’O2 si manifesta su lipidi, proteine e DNA. Un esempio è la Perossidazione lipidica Estrazione di un atomo di idrogeno dalla posizione allilica Radicale centrato sul carbonio reagisce velocemente con O2 Perossi radicale può estrarre un atomo di idrogeno da un secondo lipide Variazioni irreversibili della catena fosfolipidica Sistemi di difesa contro il danno ossidativo 1) Relegare le reazioni ossidative in compartimenti cellulari chiusi come i mitocondri e i cloroplasti 2) Sviluppare molecole capaci di catturare derivati tossici dell’ossigeno 3) Sviluppare enzimi detossificanti 4) Sistemi che sequestrano ioni metallici con attività redox 5) Sviluppare sistemi che riparano i danni Catturatori non enzimatici di specie ossidanti Vitamina E è lipofila, sta nelle membrane cellulari e protegge dalla perossidazione lipidica tocoferolo acido ascorbico glutatione Vitamina C e glutatione stanno nel citosol Sistemi che sequestrano ioni metallici con attività redox Ferritina e transferrina sequestrano il ferro impedendogli di fare reazioni indesiderate Fe2+ + H2O2 Enzimi detossificanti Catalasi Perossidasi Superossido dismutasi Fe3+ + OH- + OH. PEROSSIDASI Classe di emoproteine che catalizza l’ossidazione di molecole organiche da parte di H2O2.che viene ridotta ad acqua. H2O2 + AH2 2H2O + A Il centro metallico è un Fe(III) alto spin coordinato ad un imidazolo di una istidina. Nella sesta posizione coordina l’H2O2: gli aa presenti da questo lato guidano la coordinazione e promuovono la reazione H2O2 coordina sul Fe(III) e istidina distale media il trasferimento di un H+ in modo che entrambi gli idrogeni siano legati sull’ossigeno non coordinato al ferro Composto I è ridotto al Fe(III) di partenza a seguito di due trasferimenti elettronici. Gli elettroni provengono dal substrato che si ossida L’aa Arg polarizza il legame perossidico favorendo la rottura eterolitica di detto legame Si libera una molecola di acqua e si forma un intermedio Fe(IV)=O con il metallo in uno stato di ossidazione elevato. L’anello porfirinco è un radicale catione CATALASI È una perossidasi speciale perché il suo substrato è una seconda molecola di H 2O2. Catalizza la reazione di disproprozione di H2O2 Il Ferro (III) alto spin è coordinato assialmente dal gruppo fenolato dell’aminoacido tirosina e da una molecola di acqua che viene spostata dall’H2O2. H2O2 + H2O2 2H2O + O2 Meccanismo d’azione: Fe(III)porf + H2O2 Fe(III)porf(OOH) + H+ Fe(III)porf(OOH) Fe(IV)porf+.=O + OH- Fe(IV)porf+.=O + H2O2 O2 + Fe(III)porf + H2O Stesso meccanismo visto per le perossidasi e si forma Composto I con ferro ad alta valenza Usando H2O2 marcata si è stabilito che rottura legame O-O non avviene. Si tratta di una riduzione bielettronica del composto I da parte di H2O2, con l’ossigeno coordinato al ferro che viene rilasciato in una molecola di acqua SUPEROSSIDO DISMUTASI Sono una famiglia di metallo proteine che catalizza la disproporzione dello ione superossido attraverso un meccanismo che consiste di due passaggi consecutivi: 1) 2) Mn+ + O2- M(n-1)+ + O2 M(n-1)+ + O2- Mn+(O22-) 2H+ Mn+ + H2O2 Nello step 1) lo ione superossido riduce lo ione metallico ossidandosi ad ossigeno molecolare Nello step 2) lo ione superossido riossida lo ione metallico riducendosi a perossido La reazione complessiva è: 2O2 -+ 2H+ SOD O2 + H 2 O2 Nei mitocondri delle cellule eucariote si trova la Cu-Zn SOD consiste di due subunità identiche tenute insieme da interazioni idrofobiche il rame e lo zinco si trovano sul fondo di uno stretto canale fatto ad imbuto. Le dimensioni di questo canale consentono il passaggio solo alle molecole molto piccole (es. acqua) e agli ioni piccoli. all’imboccatura del canale sulla superficie esterna della proteina ci sono due aa lisina, che essendo carichi positivamente, attraggono lo ione superossido. lungo le pareti del canale vi è un aa arginina anch’esso positivo che ha la funzione di convogliare l’anione superossido verso il sito catalitico una modifica chimica delle lisine e della arginina comporta una forte diminuzione dell’attività della SOD Sito catalitico della Cu-Zn SOD His118 H2O His44 His 69 Cu Zn Cu2+ è coordinato a 4 imidazoli istidinici e a una molecola d’acqua. La geometria è piramidale a base quadrata con acqua nella posizione apicale Asp 81 His 46 His 78 His 61 A ponte tra i due centri metallici Zn2+ è coordinato a 3 imidazoli istidinici e al carbossilato di un aspartato Sito catalitico della Cu-Zn SOD His118 H2O His44 His 69 Cu Zn Asp 81 His 46 His 78 Cu2+ è il sito di interazione dello ione superossido. Quindi il Cu2+ è il sito His 61 su cui avviene la disproporzione: Cu2+ + O2Cu+ + O2- Rimozione dello Zn2+ non altera l’attività della SOD ma rende più instabile la proteina che si denatura a temperatura più bassa della SOD nativa Cu+ + O2 Cu2+(O22-) Cu2+ + H2O2 Zn2+ ha ruolo strutturale Attività della SOD è inibita in presenza di specie anioniche piccole come CN-, F-, N3- che competono con lo ione superossido nel sito catalitico. Reattività dell’O2 La reazione tra un substrato organico e l’O2 è termodinamicamente molto favorita perché libera una grande quantità di calore (DH negativo) DG° = DH° -TDS° La reazione tra un substrato organico e l’O2 è cineticamente molto lenta perché la barriera energetica di attivazione è molto elevata. k = Ae-Eatt./RT Energia Eatt potenziale Coordinata di reazione Il motivo sta nel fatto che O2 è allo stato fondamentale di tripletto, mentre le molecole organiche hanno stati fondamentali di singoletto (senza elettroni spaiati) la bassa velocità di reazione tra ossigeno e substrati organici ha permesso ai sistemi biologici la messa a punto di processi catalitici. L’azione degli enzimi è quella di individuare nuovi percorsi di reazione con energia di attivazione molto più bassa. Energia Eatt Eatt’ potenziale Coordinata di reazione Coordinata di reazione Funzioni dell’O2 nei sistemi biologici: monoossigenazione e diossigenazione Sorgente di atomi di ossigeno per la biosintesi di metaboliti o per la conversione di molecole idrofobiche in metaboliti più polari e solubili in acqua facilitando l’eliminazione per via renale diossigenasi RH + O2 RH + O2 + 2e- + 2H+ RHO2 monossigenasi ROH + H2O Tra le monoossigenasi gli enzimi citocromo P-450 sono stati oggetto di molti studi perché sono emoproteine il cui sito attivo è molto simile a quello della emoglobina/mioglobina e perché catalizzano la inserzione di un atomo di ossigeno in una grande varietà di substrati C C Idrossilazione di composti alifatici OH Idrossilazione di composti aromatici OH H Epossidazione di alcheni O N+_ O- N S S O Ossidazione di ammine a N-ossidi Ossidazione di solfuri a solfossidi Gli enzimi citocromo P450 sono stati difficili da caratterizzare perché sono legati alle membrane del mitocondrio e del reticolo endoplasmatico e sono poco solubili in acqua. Si è isolato quello presente nel batterio Pseudomonas putida Questi enzimi consistono di una singola catena polipeptidica (con 400-530 aa, a seconda del tipo di enzima) con un gruppo eme b (Fe-protoporfirina IX) privo di legami covalenti fra l’anello porfirinico e la proteina. L’atomo di Fe(III), legato solo ad un atomo di S di una cisteina, è in uno stato di basso spin, probabilmente con una molecola di H2O in posizione apicale. Il gruppo cisteinato RS- stabilizza il metallo nella forma ossidata Fe(III), in una configurazione a basso spin. Il potenziale redox, a pH 7 è – 330 mV. Cys Interazione con il substrato genera Fe(III) pentacoordinato ad alto spin. La variazione di spin cambia il potenziale redox a +170 mV L’aumento di potenziale favorisce la riduzione: si ottiene Fe(II) pentacoordinato ad alto spin, del tutto simile alla specie che coordina O2 in emoglobina Fe(III) esacoordinato a basso spin: potenziale redox a -330 mV XOOH XOH [(Por•+)Fe(IV)=O] O2 si coordina per dare addotto Fe(II)O2 o Fe(III)superossido Specie ossidante ed elettrofila che fa la monoossigenazione La cattura di un H+ forma un Fe(III) idroperossido, il quale per rottura eterolitica del legame O-O si trasforma in OH- che viene eliminato come H2O per acquisto di un protone. La seconda riduzione forma il complesso perossidico Similitudine tra perossidasi e citocromo P-450 R-H His + Arg O O Fe(IV)-Por+. Fe(IV)-Por+. S-Cys His Compound I Come è possibile che la stessa specie ipervalente dia due reazioni molto diverse, trasferimento di atomo di ossigeno nel cyt P-450 e trasferimento elettronico in perossidasi e catalasi? Le cavità in cui si dispone il substrato sono diverse: nel cytP450 RH è molto vicino al ferrile. Nella perossidasi alcuni aminoacidi bloccano di fatto l’avvicinamento del substrato al ferrile, rendendo possibile solo il trasferimento dell’elettrone. Come si effettua la rottura eterolitica del legame perossidico nei due sistemi enzimatici? Nella perossidasi la polarizzazione del legame è raggiunta grazie all’azione degli aminoacidi. nel citocromo P-450 tali aminoacidi non ci sono perché il complesso si trova in una tasca idrofobica. Probabilmente il legante assiale cisteina, per la sua natura basica, favorisce la rottura eterolitica. Sistemi modello del citocromo P450 sono ferro porfirine di sintesi X2 X2 X3 X1 X3 X1 X4 X4 X2 X2 X4 N N Fe X4 X4 X1 X2 X4 X1 X3 X2 X2 X1=X3=CH3; X2=X4=H FeTMP X1=Cl; X2=X3=X4=H FeTDCPP X1=X2=X3=F; X4=H FeTF5PP 3a generazione: X2 X4 X1 FeTPP 2a generazione: N N X4 X1 X3 (III) 1a generazione: X1=X2=X3=X4 = H X1 X1 Catalisi biomimetica X1=Cl; X2=X3=H; X4=Cl FeTDCPCl8P Sistemi modello del citocromo P450 h OH Ferro porfirine di sintesi/donatore di atomi di ossigeno N N N Fe . Ferro porfirine di sintesi/agente riducente chimico/O2 Ferro porfirine di sintesi/luce ultravioletta/O2. La luce è un reagente riducente rinnovabile che consente la formazione di una specie elettrofila N N N N N FeII III O2 OH O H2O H . O. O O O N N N FeIII N N III Fe N N N Funzioni dell’O2 nei sistemi biologici: fosforilazione ossidativa Negli organismi aerobi l’ossigeno è l’accettore finale di elettroni della catena respiratoria, provenienti dall’ossidazione di molecole come il glucosio o gli acidi grassi. Nella reazione, che rappresenta la sorgente principale di energia negli organismi aerobici, il prodotto di riduzione è l’acqua: O2 + 4H+ + 4e- 2H2O La respirazione cellulare è più correttamente una fosforilazione ossidativa: infatti, gli enzimi che la catalizzano accoppiano alla ossidazione del substrato organico e alla riduzione dell’ossigeno la sintesi dell’ATP a partire da ADP e fosfato. ADP + Pi ATP LA CATENA RESPIRATORIA fosforilazione ossidativa: cosa assicura la monodirezionalità del movimento degli elettroni? Fe4S4 Fe3S4 Fe2S2 Citocromo c rubredossine Citocromo a O2/H2O 800 600 400 200 0 -200 -400 Potenziale di riduzione (mV) -600 -800 Proteine ferro-zolfo Sono metallo proteine contenenti raggruppamenti atomici di ferro e zolfo con stechiometrie differenti. Sono molto antiche, hanno PM bassi, non richiedono gruppi prostetici e non possiedono aminoacidi di forma complessa. Hanno potenziali di riduzione compresi tra -0.49 e -0.05 mV. Si suddividono in: -Rubredossine (a) -Ferredossine (b, c,d) (a) rubredossine: 1Fe-0S (b) ferredossine: 2Fe-2S (c) ferredossine: 4Fe-4S (d) ferredossine: 3Fe-4S Attività si basa sulla reversibilità della coppia redox Fe(III)/Fe(II) Il ferro è coordinato da 4 S secondo geometria tetraedrica: i leganti solfuro sono a campo debole Alto spin t2g eg Fe(III) d5 meff = 5.85 no transizioni d-d Fe(II) d6 meff = 5.05 si transizione d-d che cade nell’IR Si possono distinguere forma ossidata ridotta per via spettroscopica Le ferredossine Fe2S2 sono molto diffuse nei cloroplasti delle piante e partecipano al processo fotosintetico. Dato che i numeri di ossidazione per atomi di Fe in un intorno tetraedrico sono +2 e +3, la carica del cluster può variare da 0 (Fe(II)Fe(II)) a +1 (Fe(II)Fe(III)) a +2 (Fe(III)Fe(III)). 4Fe-4S è il più diffuso cluster Fe-S in biologia Si trova nella succinato deidrogenasi. La struttura: un cubo con atomi di Fe e S ai vertici, in posizione alternata. Il cubo è ancorato alla proteina attraverso l’atomo di S di 4 cisteine, generando una geometria tetraedrica distorta per i 4 atomi di Fe. Esistono i dati strutturali di varie proteine 4Fe-4S sia nella forma ossidata che ridotta: la variazione del N.O. del metallo conseguente al trasferimento elettronico non determina importanti variazioni di geometria di coordinazione e di distanze di legame. Questo minimizza l’energia di attivazione associata al processo ossido-riduttivo rendendo il trasferimento elettronico un processo molto veloce. L’unità Fe4S4 nelle proteine può esistere in tre stati di ossidazione stabili Fe4S43+ [Fe(III)3Fe(II)] e-e- Fe4S42+ [Fe(III)2Fe(II)2] e-e- Fe4S4+ [Fe(III)Fe(II)3] CITOCROMI: emoproteine contenenti gruppi eme eme a eme c Eme b o protoporfirina IX CITOCROMO C Citocromo c è coordinato con una istidina e una metionina ed ha un potenziale redox di +260 mV È proteina solubile in acqua, a basso peso molecolare. Facile da isolare e purificare perché non è fortemente associata alla membrana mitocondriale interna. I gruppi vinilici dell’eme legano due cisteine della proteina. È proteina antica in termini evoluzionistici La funzione è tasferire un elettrone attraverso la reversibilità della coppia redox Fe(III)/Fe(II) In che modo la proteina controlla il potenziale di riduzione del centro metallico? citocromo Potenziale di riduzione (mV) Citocromo c nativo +260 mV Met-80 His-80 +40 mV Tyr 67 Phe 67 +225 mV Eme ottapeptide -50 mV Quali sono i requisiti a livello molecolare affinchè il trasferimento elettronico sia veloce? Il trasferimento di elettroni non è veloce quando le geometrie del sistema in forma ossidata e in forma ridotta sono molto diverse, cioè occorre energia per riorganizzare. I raggi X della forma ossidata e ridotta hanno dimostrato che ci sono minime variazioni. Il trasferimento dell’elettrone è più veloce del movimento dei nuclei come è possibile trasferire elettroni tra due centri redox che possono essere separati da una distanza di più di 20 Angstrom da un ambiente proteico apparentemente inerte? e- donatore ponte accettore Citocromo c ossidasi Ultimo enzima della catena respiratoria Fortemente associato con membrana mitocondriale interna Costituito da almeno 13 subunità Comprende almeno 4 centri redox Citocromo c Eme a / CuA (II) Eme a3 / CuB (II) eme è ferro basso spin esacoordinato (due imidazoli assiali). La funzione è solo di trasferimento elettronico: Eme pentacoordinato (un imidazolo). Fe(III) coordina CN- e Fe(II) coordina CO. È il sito di legame per l’O2 Meccanismo proposto per la citocromo c ossidasi (alto spin) (cyt a3)Fe(II) 3O Cu(I) 2 (basso spin) (cyt a3)Fe(II)(O2) o Fe(III)(O2-) (cyt a3)Fe(III)(O22-) Cu(I) Cu(II) +e+ 2 e- (cyt a3)Fe(III)(O22-) Cu(I) +H+ (cyt a3)Fe(III)(OOH) Cu(I) (cyt a3)Fe(II)(OOH)- - Cu(II) +H+ (cyt a3)Fe(IV)=O (H2O)Cu(II) +e- (cyt a3)Fe(III)(OH) ….(HO)Cu (II) 2H+ (cyt a3)Fe(III) Cu (II) + 2H2O fosforilazione ossidativa: cosa assicura la monodirezionalità del movimento degli elettroni? Fe4S4 Fe3S4 Fe2S2 Citocromo c rubredossine Citocromo a O2/H2O 800 600 400 200 0 -200 -400 Potenziale di riduzione (mV) -600 -800