1) walking cromosomico

Clonaggio funzionale
Conoscenza proteina
Clonaggio posizionale
Malattia genetica
Determinazione sequenza amminoac.
Mappatura genetica con marcatori
polimorfici
Deduzione sequenza nucleotidica
Identificazione cloni genomici
che coprono il sito mappato
Sintesi sonda oligonucleotidica
Ricerca del gene (varie tecniche)
Isolamento clone di cDNA
Deduzione della struttura aminoac.
Isolamento clone genomico
Ricerca mutazioni nucleotidiche
Caratterizzazione clone genomico
Ricerca funzione proteica
Ricerca delle mutazioni
METODI DI CLONAGGIO
CLONAGGIO ATTRAVERSO VETTORE
ENZIMI DI RESTRIZIONE
DIGESTIONE MULTIPLA E CLONAGGIO
Numero di cloni necessario per costruire librerie genomiche
N = ln (1 – P) / ln (1- a/b)
a = dimensione media del frammento
b = totale del genoma da clonare
P = frammento qualunque sia clonato
Specie
Dimensioni
del genoma
(bp)
Numero di cloni
Frammenti
Frammenti
da 17 kb
da 35 kb
E. coli
4,6 x 106
820
410
S. cerevisiae
1,8 x 107
3225
1500
D. melanogaster
1,2 x 108
21500
10000
Riso
5,7 x 108
100000
49000
Uomo
3,2 x 109
564000
274000
Rana
2,3 x 1010
4053000
1969000
MAPPATURA FISICA
COSTRUZIONE DI LIBRERIE GENOMICHE A PARTIRE DA DNA
OTTENUTO DA:
DNA GENOMICO TOTALE
IBRIDI SOMATICO-CELLULARI
PANNELLI DI IBRIDI MONOCROMOSOMICI
PANNELLI DI IBRIDI CON CROMOSOMI DELETI
IBRIDI DA RADIAZIONE
SINGOLI CROMOSOMI ISOLATI CON CITOMETRIA A FLUSSO
STIMA DELLA RELAZIONE TRA DISTANZA GENETICA E FISICA
Stima della distanza genetica totale (in cM) nella specie umana:
somma della lunghezza totale dei cromosomi ottenuta dalla
mappatura genetica con marcatori polimorfici
Nel maschio = 2644 cM
Nella femmina = 4481 cM
Per 3000 Mb = 3 x 10 9 bp di genoma
Maschio
1 cM = 1.13 Mb = 1.13 x 106 bp
Femmina
1 cM = 0.67 Mb = 0.67 x 106 bp
Media : 1 cM = 0.9 Mb = 0.9 x 106 bp
SEPARAZIONE DI CROMOSOMI CON CITOMETRIA A FLUSSO
GENOMA UMANO
VETTORI DI CLONAGGIO
DIMENSIONI DELL’INSERTO
Vettori plasmidici standard
0 - 10 Kb
Vettori lambda
10 - 20 Kb
Vettori cosmidici
30 - 44 Kb
Vettori BAC (cromosomi artificiali batterici)
fino a 300 Kb
Vettori YAC (cromosomi artificiali di lievito)
0.3 - 2.0 Mb
Libreria di DNA genomico in termini di genoma-equivalenti
1 genoma equivalente: 3000 Mb/40 Kb = 75000 cloni indipendenti
ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:
1) walking cromosomico:
- con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive);
- con le estremità dei cloni
2) fingerprinting per identità di:
- mappa di frammenti di restrizione
- presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione,
- prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE,
intersperse repetitive elements, es. Alu),
3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da
una sequenza)
DIGESTIONE PARZIALE DEL DNA E PRODUZIONE DI CLONI CON
FRAMMENTI CHE SI SOVRAPPONGONO
CHROMOSOME WALKING
METODI PER L’ANALISI DEI CLONI GENOMICI PER ORDINARLI
IN CONTIGUI
- Distribuzione dei cloni in piastre da microtitolazione per produrre
griglie ordinate
- Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare per analisi con
ibridazione
- Produzione di pool di DNA di cloni e selezione attraverso PCR
specifiche
- Piastra agar con cloni ricombinanti
-Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione con
pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter)
- Produzione filtro corrispondente
Libreria specifica del cromosoma 6 con cloni ordinati su griglia
- Piastra di agar 22 x 22 cm con cloni ricombinanti
-Trasferimento delle singole colonie in piastre di microtitolazione
con pozzetti con terreno (96 pozzetti per microtiter)
- Trasferimento delle singole colonie in piastre da microtitolazione
ad alta densità 96 x 4 = 384 pozzetti per microtiter
- Trasferimento automatizzato su filtro
54 microtiter x 384 pozzetti = 20736 cloni = 4 genomi equivalenti
ASSEMBLAGGIO DEI CLONI IN CONTIGUI ATTRAVERSO:
1) walking cromosomico:
- con cloni interi (e soppressione di sequenze ripetitive);
- con le estremità dei cloni
2) fingerprinting per identità di:
- mappa di frammenti di restrizione
- presenza DNA ripetitivo in frammenti di restrizione,
- prodotti PCR compresi tra elementi ripetuti (IRE,
intersperse repetitive elements, es. Alu),
3) contenuto di Sequence Tagged Site (STS) (Siti contrassegnati da
una sequenza)
FINGERPRINTING PER MAPPA
DI FRAMMENTI DI RESTRIZIONE
Presenza nei diversi cloni di
frammenti di restrizione della stessa
dimensione
FINGERPRINTING DEI CLONI PER PRESENZA DI DNA RIPETITIVO
IRE = elementi ripetuti
intercalati, es sequenze Alu:
inter Alu-PCR
ASSEMBLAGGIO DI CLONI MEDIANTE ANALISI DEL CONTENUTO DI
SEQUENCE TAGGED SITE (STS) (SITI ETICHETTATI DA UNA SEQUENZA)
STS = sequenza a singola copia amplificabile con PCR
La presenza del prodotto PCR di peso molecolare atteso rivela la presenza
di quella STS all’interno di un clone
ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS
ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS
Screening di intere librerie genomiche con PCR su pool di DNA
PREPARAZIONE DI POOL DI DNA DI CLONI YAC E SCREENING CON PCR
CLONAGGIO POSIZIONALE:
UTILIZZO DEI MARCATORI ASSOCIATI GENETICAMENTE PER
COSTRUZIONE DI UN CONTIGUO DI CLONI GENOMICI