CREAZIONE CREAZIONE DI DI BIBLIOTECHE BIBLIOTECHE GENOMICHE GENOMICHE Realizzazione di una banca genomica in un vettore plasmidico (*) (**) (***) Frammenti di DNA ottenuti dalla digestione parziale con un enzima di restrizione: - cloni che contengono l’intero gene (*) - cloni che ne contengono una parte (**) - cloni che non contengono nessuna parte del gene (***) Trovare il “clone” giusto Leggere la sequenza CGGCATTTGCGTATTCGGCC TAGCTACTCGTACCCCTGAT AGGTGTGCATTTAGGGCACT GCAGGGCCTCGGCAATCCGC CCCGGTGTGAATAAATCGTA Genoteca in vettori plasmidici (o cosmidici) Genoteca in vettori fagici Introduzione dei vettori in cellule batteriche ospiti Plasmidi trasformazione Colonie Fagi o cosmidi infezione Placche di lisi OGNI COLONIA E’ UN CLONE INDIPENDENTE! Ogni piastra da 15 cm di diametro può contenere 20000-50000 colonie o placche sufficientemente separate Una libreria rappresentativa deve contenere circa 6-8 x 105 colonie Screening di circa 20 piastre con 40000 colonie ciascuna TROVARE TROVARE II GENI GENI Come trovare il gene che ci interessa fra parecchi milioni di cloni? Per individuare i cloni che contengono il gene di interesse o una sua parte possiamo utilizzare una sonda a DNA o RNA (come visto finora). Analisi dei cloni ottenuti Taglio con enzimi di restrizione usati per il clonaggio Frammenti da analizzare Crescita dei cloni, purificazione del DNA plasmidico o fagico e analisi con enzimi di restrizione Sequenziamento Sottoclonaggio Frammenti inseriti ““LEGGERE” LEGGERE” LA LA SEQUENZA SEQUENZA DEL DEL DNA DNA Sequenziamento del DNA metodo metododi diSanger Sangeroodei deiddNTPs ddNTPs Sequenziamento automatizzato Elettroforesi GAACGTCCGGAACGTAGGG A C G T Lettura Laser Fluorimetro Con la tecnologia del DNA ricombinante è possibile ottenere cellule e organismi geneticamente modificati Studio della funzione di geni clonati Miglioramento della produttività di piante e animali importanti nell’agricoltura Possibilità di terapia genica nell’uomo Genoteche ’espressione oo di Genoteche dd’espressione di cDNA cDNA Realizzazione di una genoteca d’espressione (banca di cDNA) a) selezione degli mRNAs b) retrotrascrizione degli mRNAs c) Clonaggio dei cDNA in vettori plasmidici Perchè identificare un clone di cDNA in una genoteca di espressione: 1- Per produrre in vitro una proteina di interesse terapeutico (es. insulina). 2- Per ottenere una sonda in grado di “pescare” il gene in una banca genomica della stessa specie (sonda omologa) o di specie diverse (sonda eterologa). 3- Per identificare il gene in grado di complementare una funzione persa in una cellula mutante