creazione di biblioteche genomiche creazione di biblioteche

CREAZIONE
CREAZIONE DI
DI BIBLIOTECHE
BIBLIOTECHE GENOMICHE
GENOMICHE
Realizzazione di una
banca genomica in un
vettore plasmidico
(*)
(**)
(***)
Frammenti di DNA ottenuti dalla
digestione parziale con un enzima di
restrizione:
- cloni che contengono l’intero gene
(*)
- cloni che ne contengono una parte
(**)
- cloni che non contengono nessuna
parte del gene (***)
Trovare il “clone” giusto
Leggere la sequenza
CGGCATTTGCGTATTCGGCC
TAGCTACTCGTACCCCTGAT
AGGTGTGCATTTAGGGCACT
GCAGGGCCTCGGCAATCCGC
CCCGGTGTGAATAAATCGTA
Genoteca in vettori plasmidici
(o cosmidici)
Genoteca in vettori fagici
Introduzione dei vettori in cellule batteriche ospiti
Plasmidi
trasformazione
Colonie
Fagi o cosmidi
infezione
Placche di lisi
OGNI COLONIA E’ UN CLONE INDIPENDENTE!
Ogni piastra da 15 cm di diametro può
contenere 20000-50000 colonie o placche
sufficientemente separate
Una libreria rappresentativa deve
contenere circa 6-8 x 105 colonie
Screening di circa 20 piastre con
40000 colonie ciascuna
TROVARE
TROVARE II GENI
GENI
Come trovare il gene che ci interessa fra parecchi milioni di cloni?
Per individuare i cloni che contengono il gene di interesse o una sua parte possiamo
utilizzare una sonda a DNA o RNA (come visto finora).
Analisi dei cloni ottenuti
Taglio con enzimi di
restrizione usati
per il clonaggio
Frammenti
da analizzare
Crescita dei cloni, purificazione
del DNA plasmidico o fagico e
analisi con enzimi di restrizione
Sequenziamento
Sottoclonaggio
Frammenti inseriti
““LEGGERE”
LEGGERE” LA
LA SEQUENZA
SEQUENZA DEL
DEL DNA
DNA
Sequenziamento del DNA
metodo
metododi
diSanger
Sangeroodei
deiddNTPs
ddNTPs
Sequenziamento automatizzato
Elettroforesi
GAACGTCCGGAACGTAGGG
A
C
G
T
Lettura
Laser
Fluorimetro
Con la tecnologia del DNA ricombinante è possibile
ottenere cellule e organismi geneticamente modificati
Studio della funzione di geni clonati
Miglioramento della produttività di piante e animali importanti
nell’agricoltura
Possibilità di terapia genica nell’uomo
Genoteche
’espressione oo di
Genoteche dd’espressione
di cDNA
cDNA
Realizzazione di una genoteca d’espressione
(banca di cDNA)
a) selezione degli mRNAs
b) retrotrascrizione degli mRNAs
c) Clonaggio dei cDNA in
vettori plasmidici
Perchè identificare un clone di cDNA in una
genoteca di espressione:
1- Per produrre in vitro una proteina di interesse terapeutico (es. insulina).
2- Per ottenere una sonda in grado di “pescare” il gene in una banca
genomica della stessa specie (sonda omologa) o di specie diverse (sonda
eterologa).
3- Per identificare il gene in grado di
complementare una funzione persa
in una cellula mutante