La possibilita’ di conoscere i geni
deriva dalla capacita’di manipolarli:
-isolare un gene (enzimi di restrizione)
-clonaggio (amplificazione)
vettori
-sequenziamento
-funzione
Il gene o la sequenza genica isolata deve
essere inserita all’interno di un vettore che
permette l’amplificazione (aumento del
numero di copie) della sequenza stessa, in
modo che il gene diventi manipolabile
COSTRUZIONE DI VETTORI DI
CLONAGGIO
-
Plasmidi (fino a 10kb)
Vettori fagici (fino a 15 Kb)
Vettori cosmidici (fino a 45 Kb)
BAC (basati sul fattore F di E.Coli, inserto
fino a 300 Kb)
- PAC (basati sul genoma fagico P1, fino a
120 Kb)
- YAC cromosomi artificiali di lievito (inserto
fino a 2 Mb)
Proprieta’ di un vettore di clonaggio
VETTORE
PLASMIDICO
-si replica
autonomamente
rispetto al
cromosoma
batterico
-possiede un
polylinker
-possiede un
marcatore di
selezione
Vettore d’espressione
Vettori
fagici
e cosmidi
Alta afficienza
di infezione e quindi
di trasferimento del
gene
clonato
all’interno
della cellula batterica
YAC, cromosomi artificiali di lievito o minicromosomi,
inseriti nelle cellule attraverso microiniezione o liposomi,ospitano fino a
500 Kb di DNA
BAC
cromosomi
batterici
artificiali
Genoteca
o libreria
genomica
-amplificare frammenti
o geni
-identificare geni
-determinare nuovi geni
-contiene geni nella
loro forma nativa con
sequenze regolative ed
introni
-ogni vettore porta un
pezzo del genoma, e
tutti i vettori insieme
rappresentano tutto il
genoma
Genoteca di c-DNA:genoteca di sequenze
espresse
-ogni vettore porta
un c-DNA, quindi
un trascritto genico,
e tutti i vettori
insieme
rappresentano tutto
il trascrittoma
Caso 1. Si conosce la funzione del gene ma non
la sequenza genica ne’ la proteina
IDENTIFICAZIONE DEI CLONI PER
COMPLEMENTAZIONE
La complementazione funzionale è il
processo mediante il quale una particolare
sequenza di DNA è in grado di compensare
la mancanza di una funzione in una cellula
mutante, ripristinando così il fenotipo
Wild-type.
Yeast to human: rescue
CDK=chinasi
ciclina
dipendente
Poiche’ conosco le sequenze a monte e a valle del pezzo di
genoma clonato,
mi posso costruire dei primers che
permettono di amplificre e sequenziare l’inserto
Caso 2: se e’ nota la sequenza del
gene posso costruire una sonda di
DNA / RNA che andra’ ad ibridare con
la
sequenza
genica
Caso 3: non conosco la sequenza
genica ma conosco la sequenza
aminoacidica
anche qui
costruisco una sonda a DNA/RNA,
tenendo conto della degenerazione del
codice genetico
SAGGI DI IBRIDAZIONE
STANDARD E SAGGI INVERSI
• STANDARD
COLONY-BLOT
SOUTHERN BLOT
NORTHERN BLOT
IBRIDAZIONE IN SITU SU TESSUTO O CROMOSOMI
• INVERSI (MARCATURA DEL TARGET)
MICROARRAY DI DNA
MICROARRAY DI OLIGONUCLEOTIDI
L’IMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E’
UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICA
MOLECOLARE
SI SFRUTTA LA CAPACITA’ DELLE MOLECOLE DI
ACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI
FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO
IBRIDAZIONE
I SAGGI PIU’ COMUNI DI IBRIDAZIONE PREVEDONO L’USO DI
SONDE
SONDE:MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO O DOPPIO
FILAMENTO MARCATE
sequenza di DNA genomico o di c-DNA
Sonda (probe) marcata di 15-100 nt
- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA
CERCANDO
- PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI
CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA)
- PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE
- PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI
CON ALTRE TECNICHE)
- PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL
TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET
COLONY-BLOT
Chromosome walking
Il risultato dello screening di una libreria di cDNA ma,
specialmente di una libreria genomica è quasi sempre
un clone che non comprende l’intero gene. Per isolare il
gene intero si utilizza una tecnica chiamata chromosome
walking. Questa tecnica presuppone che la libreria sia
formata da cloni parzialmente sovrapposti tra loro. La
tecnica consiste nell’utilizzare il cDNA isolato come
sonda con cui si sonda una nuova libreria (di solito
genomica) Il risultato di questo screening dovrebbe dare
dei nuovi cloni una parte dei quali si estenderà
ulteriormente verso il 5’, il 3’ o entrambe le direzioni. I
cloni più esterni saranno nuovamente utilizzati come
sonde per isolare nuovi cloni che si estendono al 5’ o al
3’ ecosì via fino ad isolare l’intero gene.
La reazione di amplificazione del
DNA o PCR
