XXI ciclo di Dottorato di Ricerca in Neuroscienze Applicate
Alessandro Geroldi
Relazione II anno
Docente tutor: Dott.ssa Emilia Bellone
Titolo del progetto: Forme gravi della malattia di Charcot-Marie Tooth (CMT) ad insorgenza
precoce: implementazione dell’analisi molecolare per i casi privi di una definizione genetica.
Scopo del progetto: implementazione dell’analisi molecolare dei geni responsabili delle forme di
CMT gravi ad insorgenza precoce.
Risultati ottenuti nel II anno
1. Ampliamento del database, già definito nel corso del primo anno, grazie al reclutamento di
nuovi pazienti con una neuropatia ad esordio infantile, sia assonale sia demielinizzante. Tale
reclutamento è stato effettuato tramite l’Ambulatorio Integrato per lo studio delle
Neuropatie periferiche dell’Università di Genova e tramite la collaborazione con l’Unità
Operativa di Neuropsichiatria Infantile dell’Istituto Gaslini di Genova.
2. Il reclutamento è stato effettuato rispettando i criteri già utilizzati nel I anno:
a. presenza di neuropatia sensitivo-motoria con esordio nella I-II decade di vita
b. assenza di sintomi clinici e neurofisiologici nei genitori
c. presenza di consanguineità o presenza almeno di un fratello affetto
3. esclusione della duplicazione della regione 17p11.2 mediante Pulse-Field Gel
Electrophoresis (PFGE) e della presenza di mutazioni puntiformi nei geni GJB1 (CX32),
MPZ e PMP22 allo scopo di escludere la presenza di mutazioni de-novo.
4. inclusione dei nuovi casi risultati negativi alle precedenti analisi molecolari nei sottogruppi
precedentemente creati sulla base delle caratteristiche cliniche, neurofisiologiche e
neuropatologiche
5. l’analisi mutazionale è stata effettuata nelle seguenti fasi:
a. Isolamento della regione codificante di ciascun gene incluse le giunzioni introneesone, mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
b. effettuazione dello screening mediante Denaturing High Performance Liquid
Chromatography (DHPLC). Il passaggio dalla tecnica Single Strand Conformation
Polymorphism (SSCP), precedentemente utilizzata, alla tecnica DHPLC ha reso
necessario la creazione di un progetto d’analisi ad almeno due temperature di
melting in modo da coprire interamente il frammento analizzato in cromatografia.
c. sequenziamento diretto delle eventuali varianti identificate su sequenziatore
automatico
L’attività di ricerca relativa a questo secondo anno di attività ha riguardato in particolare:
1. la ricerca di mutazioni puntiformi nel gene GDAP1 (ganglioside-induced differentationassociated protein), descritte in associazione a un quadro di neuropatia periferica a
prevalente trasmissione di tipo autosomico recessiva.
2. la ricerca di mutazioni puntiformi nel gene EGR2 (early-growth-response-2) in un gruppo
selezionato di 4 pazienti con un quadro grave di neuropatia periferica ad esordio precoce.
1. Ricerca di mutazioni puntiformi nel gene GDAP1.
Il gene GDAP1 è localizzato in posizione 8q21.1, ha una dimensione di 13.9 kb per un totale di 6
esoni. E’ espresso nel sistema nervoso periferico (SNP) ma anche in diversi distretti del Sistema
Nervoso Centrale (SNC); nel SNP è espresso sia nei neuroni sia nelle cellule di Schwann (Suter e
al. 2005). GDAP1 codifica per una proteina di 358 aminoacidi con 2 domini transmembrana (TM) e
2 domini glutathione S-transferase (GST), al N- e al C- terminale; nonostante la presenza dei domini
GST, non è stata dimostrata alcuna azione detossificante della proteina. GDAP1 sembra piuttosto
essere una componente della membrana mitocondriale esterna che controlla l’equilibrio tra fusione
e fissione mitocondriale.
Mutazioni nel gene GDAP1 sono associate a neuropatie periferiche sia con fenotipo demielinizzante
sia con fenotipo assonale a trasmissione prevalentemente recessiva. Sono stati recentemente
descritti casi a trasmissione dominante (Claramunt et al, 2005).
E’ stata esaminata una serie di 54 pazienti italiani con una neuropatia periferica a possibile
trasmissione recessiva per mutazioni puntiformi in questo gene.
E’ stata analizzata l’intera regione codificante del gene, costituita da 6 esoni, incluse le giunzioni
esone-introne. Lo screening è stato effettuato mediante Single Strand Conformation Polymorphism
(SSCP) (per i primi 30 casi) e successivamente mediante Denaturing High Performance Liquid
Chromatography (DHPLC).
Il candidato ha effettuato il disegno dei primers in modo da ottenere amplicons con temperatura di
melting omogenea e di lunghezza tale (circa 300bp) da poter essere utilizzati sia per l’analisi con
DHPLC sia per il successivo sequenziamento automatico. Il DHPLC lavora in condizioni di
parziale denaturazione e il frammento di DNA in analisi deve essere mantenuto in tali condizioni
per tutta la sua lunghezza. Questo ha reso necessario una scelta dei primers mirata a definire la
lunghezza degli amplicons in modo da utilizzare il minor numero possibile di temperature di
melting per l’analisi.
Gli amplificati che presentavano un profilo di corsa (SSCP) o cromatografico (DHPLC) diverso
rispetto a una serie di controlli normali sono state successivamenti analizzati mediante
sequenziamento diretto. Il sequenziamento ha evidenziato la presenza di alcune varianti,
rispettivamente negli esoni 1, 2 , 3 e 4 del gene. (Tab.1)
Tabella 1
Esone
Variante
N° individui
Descrizione
Ex1
c.72 T>C V24V
1
Variante non
descritta
1 + genitori
Variante non
descritta
1
Variante non
descritta
1
Varianti
precedentemente
descritte
18 + 2 controlli
polimorfismo
c.146 T>C L49S
Ex2
c.263 G>T
C88F
c.247 G>A
G83R
omozigosi
Ex 3
Ex 4
c.347 T>G
M116R
c.358T C>T
R120W
c.507 G>T
S169S
Riferimento
Ammar et al.,
(2003)
Bellone etal.,
(2004)
Senderek et al.
(2003)
Esone 1.
Si tratta di una transizione T>C in posizione 72 (c.72 T>C) che non determina un cambio
aminoacidico al codone 24 (V24V). Essendo una mutazione silente, presumibilmente è priva
di rilevanza clinica.
Esone 2.
In due pazienti è stato osservato un profilo di corsa elettroforetica al SSCP differente rispetto ai
controlli normali. Il successivo sequenziamento di tali frammenti ha evidenziato la presenza di tre
differenti varianti.
Il sequenziamento diretto di uno di questi ha evidenziato una transizione T>C in posizione 146
(c.146 T>C) che porta ad un cambio aminoacidico da Leu a Ser al codone 49 (L49S) e una
transversione G>T in posizione 263 (c.263 G>T) che comporta un cambio aminoacidico da Cys
a Phe al codone 88 (C88F). L’analisi ha dimostrato che la mutazione era presente nel probando
in eterozigosi composta. Per valutare la segregazione della mutazione sono stati
successivamente esaminati i genitori del probando. Il sequenziamento diretto ha rilevato la
presenza della variante c.146 T>C nella madre e della variante c.263 G>T nel padre
dimostrando che i genitori, clinicamente ed elettrofisiologicamente normali, e non consanguinei,
erano portatori eterozigoti. L’analisi tramite SSCP ha escluso la presenza di tali varianti in 200
cromosomi di controllo, indicando che non si tratta di un polimorfismo. Entrambe le mutazioni
non sono state ancora riportate in letteratura. Le mutazioni sono state identificate in un paziente
con quadro clinico di neuropatia assonale ad insorgenza precoce, notevolmente invalidante
(necessità di ausili ortopedici) e caratterizzato dalla comparsa di disfonia nella terza decade di
vita.
Il sequenziamento diretto di uno di questi frammenti ha evidenziato una transizione G>A in
posizione 247 (c.247 G>A) che porta ad un cambio aminoacidico da Gly a Arg al codone 83
(G83R). L’analisi ha dimostrato la presenza di tale mutazione in omozigosi. Non è stato
possibile eseguire l’analisi sui genitori del soggetto che peraltro provengono dal medesimo
paese con ≤2500 abitanti. L’analisi tramite SSCP e DHPLC ha escluso la presenza di tale
variante in 200 cromosomi di controllo, indicando che non si tratta di un polimorfismo. Questa
mutazione non è stata ad oggi descritta in letteratura. La mutazione è stata identificata in un
paziente con una neuropatia prevalentemente assonale ad esordio infantile; ad oggi il paziente
(28) non necessita di ausili ortopedici per la deambulazione che risulta peraltro piuttosto
compromessa.
Esone 3.
In un paziente è stato osservato un profilo cromatografico al DHPLC differente rispetto ai controlli
normali. Il successivo sequenziamento ha evidenziato la presenza di due varianti.
Il sequenziamento diretto ha evidenziato, nel probando, una mutazione in eterozigosi
composta; in particolare è stata dimostrata la presenza della transversione G>T in posizione
347 (c.347 G>T) e della transizione C>T in posizione 358 (c.358 C>T). I rispettivi cambi
aminoacidici risultano essere Met per Arg al codone 116 (M116R) e Arg per Trp al codone
120 (R120W). Non è stato possibile effettuare l’analisi molecolare dei genitori del probando
per verificare la segregazione della mutazione. Le mutazioni c.[347 T>G] + c.[358 C>T]
sono già state descritte in letteratura associate a malattia ma mai in associazione tra loro. In
particolare la mutazione c.[358 C>T] è stata descritta da Ammar e colleghi (2003) e la
mutazione c.347 T>G da Bellone e colleghi (2004) (effetto fondatore in Campania). Le
mutazioni sono state identificate in un giovane paziente con un esordio di malattia intorno al
secondo anno di vita; il quadro neurofisiologico è prevalentemente demielinizzante con
grave riduzione delle velocità di conduzione sensitive e motorie. Attualmente il paziente (17
anni) necessita di sedia a rotelle
Esone 4
La variante c.507 G>T, che non comporta un cambio aminoacidico (S169S), è un
polimorfismo silente molto diffuso nella popolazione europea (oltre 33% nella nostra
casistica).
2. Ricerca di mutazioni puntiformi nel gene EGR2 (early-growth-response-2)
Sono stati analizzati 4 pazienti italiani con neuropatia periferica grave, associata anche a
presenza di disturbi respiratori o scoliosi importante, per mutazioni puntiformi nel gene
EGR2. E’ stata analizzata l’intera regione codificante del gene, incluse le giunzioni esoneintrone mediante sequenziamento diretto. L’analisi dei quattro pazienti non ha evidenziato
alcuna mutazione. In tutti i soggetti analizzati è stata identificata una transizione c.627
G>A, in omozigosi, che non determina un cambio aminoacidico al codone 209 (P209P).
Tale variante risulta essere un polimorfismo silente normalmente presente nella popolazione
(rs 224084).
Conclusioni preliminari
La CMT costituisce la malattia ereditaria del nervo più comune in età pediatrica, rappresentando
circa il 20% di tutte le malattie neuromuscolari nel bambino. I geni associati a queste forme di
neuropatie sono di recente identificazione sia per le forme dominanti (GDAP1, MFN2, EGR2) sia
per le forme recessive (GDAP1, EGR2, LMNA).
L’analisi molecolare effettuata fino a questo momento in 54 pazienti selezionati con una neuropatia
periferica grave ad insorgenza precoce, ha identificato 5 mutazioni GDAP1 in 3 casi indice. Tra
questi, due erano eterozigoti composti ed uno omozigote, a conferma che la trasmissione di tipo
autosomico recessiva rappresenta la forma più frequente di neuropatia periferica associata a
mutazioni in questo gene. Solo recentemente, sono state riportate mutazioni GDAP1 associate a una
trasmissione di tipo dominante (Claramunt et al, 2005), con esordio tardivo e quadro clinico lieve.
Nella coorte di pazienti italiani analizzati dal candidato, la frequenza di mutazione per il gene
GDAP1 è del 9.2%.
La ricerca di mutazioni EGR2, condotta su un gruppo di casi molto selezionati non ha evidenziato
alcuna variante associabile a malattia. D’altra parte, anche la frequenza di mutazione per questo
gene riportata in letteratura è estremamente bassa (≤ 1%)
L’analisi molecolare effettuata fino a questo momento conferma nella nostra popolazione il ruolo
predominante di GDAP1 nella patogenesi delle neuropatie ad esordio precoce.
Ci si propone, per il prossimo anno di ricerca, di ampliare la casistica per l’analisi per i geni
GDAP1 ed EGR2 e di estendere l’analisi anche al gene Lamin A/C, responsabile di forme assonali
a trasmissione recessiva.
I risultati relativi all’analisi molecolare del gene GDAP1 sono stati presentati a:
XI Riunione del Gruppo di Studio sul Sistema Nervoso Periferico, Siena, 12-14 aprile
2007 (comunicazione orale)
Congresso Società Italiana Neurologia Firenze, 13-17 ottobre 2007
