PCR

PCR
Polymerase Chain Reaction
Reazione a catena della DNA Polimerasi
Old Faithfull (???)
Kary Banks Mullis
Premio Nobel per la Chimica nel 1993 assieme a Michael Smith
PCR - REAZIONE a CATENA della POLIMERASI
DNA
1
E’ “IL” mezzo per produrre in vitro grandi quantità di una specifica sequenza di
DNA, anche partendo da tracce di DNA estremamente complesso, come l’intero
1 x 109
genoma umano.
PCR
Il meccanismo a cui si richiama la PCR è la replicazione del DNA:
REPLICAZIONE
PCR
Primer a RNA
3’
5’
Nuovo filamento
5’
3’
DNA stampo
DNA polimerasi
Primer
oligonucleotidico
DNA polimerasi
Nuovo filamento
DNA stampo
5’
Primers
a RNA
3’
5’
3’
Nuovo filamento
3’
5’
3’
5’
COMPONENTI di una REAZIONE di PCR
Mg2+
Stampo
DNA
Primers
Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti opposti che
fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio
Deossiribonucleotidi trifosfati
Tampone contenente
cloruro di magnesio
Enzima
Miscela equimolare di dATP, dTTP,
dGTP, dCTP
Lo ione Mg2+ è essenziale per il
funzionamento dell’enzima
Una Taq polimerasi, cioè una DNA Polimerasi
termostabile. La “Taq” polimerasi è stata la
prima scoperta, estratta dal batterio termofilo
Thermus aquaticus
Oggi ne esistono molte, tutte estratte da batteri
estremofili
La PCR è una procedura che
prevede cicli ripetuti, composti
ciascuno da tre fasi
1) DENATURAZIONE:
Il DNA viene denaturato mediante riscaldamento
in provetta a ~ 92-95°C
2) ANNEALING:
La miscela viene raffreddata gradualmente fino a
raggiungere la temperatura che garantisce la
specifica ibridazione dei primers alle regioni dello
stampo ad essi complementari
3) ALLUNGAMENTO:
La temperatura della miscela viene portata a 70-72°C consentendo alla DNA
polimerasi termostabile di sintetizzare il filamento complementare allo stampo
a partire dall’innesco oligonucleotidico
I primi 4 cicli della PCR in dettaglio
3° ciclo
Frammento desiderato
4° ciclo
2° ciclo
Amplificazione
esponenziale
1° ciclo
30° ciclo
DNA stampo
Numero di copie di DNA
contenenti il frammento
desiderato
Numero di copie di DNA della
corretta lunghezza contenenti
il frammento desiderato
21 = 2
0
22 = 4
0
23 = 8
2
24 = 16
8
230
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
II ciclo
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
II ciclo
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
II ciclo
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
II ciclo
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
II ciclo
III ciclo
Amplificazione del DNA mediante Polymerase Chain Reaction (PCR)
+
II ciclo
III ciclo
denat.
T = 94°C
anneal.
exten.
T = 72°C
nuovo
DNA
23 = 8
8 molecole di DNA in 3 cicli
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Ad ogni ciclo di PCR il numero di molecole di DNA
bersaglio (tratto di DNA incluso tra i due primer) raddoppia.
In una PCR di 30 cicli per ogni molecola di DNA
inizialmente presente se ne formeranno 230, cioè un numero
dell’ordine di 109.
•http://youtu.be/iQsu3Kz9NYo
Resa teorica di una reazione di PCR a partire da una
singola copia di DNA
Numero di cicli
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Numero di molecole di amplificati
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1.024
2.048
4.096
8.192
16.384
32.768
65.536
131.072
n
262.144
524.288
1.048.576
Y= numero molecole di DNA
2.097.152
amplificato
4.194.304
N= numero molecole di DNA
8.388.608
16.777.216
di partenza
35.544.432
n= numero dei cicli di PCR
67.777.216
134.217.728
268.435.456
536.870.912
1.073.741.724
Y= N2
Log [DNA]
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Plateau
Lineare
Esponenziale
Prodotto
variabile
N° cicli
Resa teorica: 2n
P =(2)n T
Il prodotto di PCR (P) incrementa esponenzialmente con il
numero di cicli di PCR (n).
P dipende da T, numero di copie di stampo di DNA di partenza
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato
da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Riappaiamento dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
PRINCIPALI FATTORI CHE INFLUENZANO LA RESA
DELLA PCR
Specificità
Sensibilità
Riproducibilità
Scelta dei primers
Condizioni di reazione
Contaminazione
Scelta dei primers
Complessità e quantità del DNA su cui si amplifica
Presenza di inibitori
Tipo di campione
Efficienza della reazione
Standardizzazione delle fasi del metodo:
preparazione del campione
protocollo di PCR
sistema di rivelazione
Specificità dei Primers per la PCR
Specificità  lunghezza
E’ il parametro più importante, perchè la specificità della PCR dipende fondamentalmente dalla
specificità dei primers.
Il fattore che determina in modo predominante la specificità dei primers è la loro
lunghezza; maggiore la lunghezza, maggiore la specificità
Questo è comprensibile grazie a considerazioni di tipo probabilistico. Infatti in pratica con
primers “specifici” si intendono quei primers che sono in grado di riconoscere in una DNA
molto complesso come quello di un intero genoma solamente la sequenza ad essi
complementare.
La domanda da porsi in sostanza è: se scelgo un primer lungo n nucleotidi, con quale
PROBABILITA’ mi aspetto di trovare la sequenza scelta sul DNA target?
Poichè le basi sono di 4 tipi la probabilità che la sequenza di un primer di n basi sia “unica” è
P=1/ 4n
Con n=5 P=9.77x10-2 con n=10 P =9.5410-7 con n=16 P=2.32 10-10 n=20 P=9.1x10-13
Come si vede con primers lunghi 16-20 nucleotidi si è abbastanza al sicuro per quanto riguarda
la specificità, anche considerando DNA target in genomi molto complessi come quello umano.
Infatti considerato che il genoma umano è in tutto 3 10 9 bp, un primer lungo 20 ha una P di
9.1x10-13 di capitare sul genoma umano altrove PER CASO; cioè ogni 1/9.1 10-13 coppie di basi
= 1 ogni circa 1012 coppie di basi….
CARATTERISTICHE dei PRIMERS
Caratteristiche di un buon primer:

Lunghezza: 16 bp o più, tipicamente 20 nucleotidi
Una sequenza di 16 bp sarà statisticamente presente solo una volta ogni 4 16 bp (~ 1 ogni 4
miliardi di basi) corrispondenti circa alla grandezza del genoma umano.

Tm primer 1
~
Tm primer 2
La Tm dipende dalla lunghezza e dalla sequenza del primers
Tm vuol dire Temperatura di melting. E’ quella temperatura alla quale il primers si dissocia dal
DNA. Dipende dalla composizione in basi del primer. Ci sono due formule per calcolarla, la prima è
imprecisa e facile: Tm = 4(G+C)+2(A+T)°C
La seconda formula è quella precisa (K è la forza ionica della reazione di PCR, len è la lunghezza del
primer): Tm = 0.41 x (% G+C) + 16.6 x log[K(+)] - 675 / len + 81.5
Comunque la calcolano automaticamente i programmi con i quali si “cercano” i primers su un DNA
da amplificare
Quando si fa la PCR la temperatura a cui si fa l’associazione del primer sul DNA deve essere
ovviamente più bassa della temperatura di melting che è quella di dissociazione del primer
dallo stampo di DNA. Quindi nella PCR il primer si utilizza a una temperatura di annealing Ta
che è circa più bassa di quella di melting
La T annealing è in genere circa 5°C al di sotto della Tm dei primers usati

Se la temperatura di melting e quindi di annealing dei due primers è molto diversa si
possono verificare amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento.
Disegno dei Primers – assenza di ripetizioni interne
Sequenze complementari interne ai primers
- I primers devono essere progettati in modo da NON avare omologie interne superiori
a 3 basi. Altrimenti formano strutture a forcina che sono negative per la PCR
- Un altro pericolo è che la omologia intrasequenza o tra i due primers che possono
portare alla formazione di associazioni tra primerss che interferiscono con la
PCR abbassandone la resa (dimeri dei primers soprattutto) se l’omologia è al 3’
Contenuto in G/C
- idealmente un primer dovrebbe avere un contenuto di G/C e A/T bilanciato, intorno al 50% ciascuna coppia
- I primers non dovrebbero contenere “runs” cioè successioni di C e G oltre 3 massimo perchè altrimenti il
rischio di annealing aspecifico aumenta significativamente
Regione al 3’ del primer
- La sequenza al 3' del primer è essenziale per il controllo e la minimizzazione di falsi inneschi.
- l’inclusione di una G o C all’estremità 3' end dei primers aiuta l’innesco della sinetsi da parte della DNA
polimerasi stabilizzando meglio la coppia di basi rispetto a una eventiuale coppia A/T
La scelta dei primers si può fare in
rete su siti appositi
• Tra i molti tools online si può usare quello che si chiama
Primer3
• http://primer3.ut.ee/
• Le opzioni di utilizzo e i parametri impostabili sono
moltissimi ma il programma ha impostazioni standard che
vanno bene per la maggior parte dei casi
• Tools come Primer3 selezionano coppie di primers
ottimizzate per la PCR sulla sequenza target fornita
dall’utente
Precauzioni da adottare nella predisposizione della
miscela di reazione per una PCR
Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP al fine di
evitare amplificazioni non specifiche.
Dosare accuratamente la [Mg2+] in funzione della quantità di stampo, primers e
dNTP utilizzata
Mg2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi, ma è
chelato da stampo, primers e dNTP.
Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte dell’enzima.
Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità
Emivita alla temperatura di denaturazione
Processività
Capacità di correzione degli errori

Taq,
Pfu...
I FATTORI CRITICI della PCR nella programmazione dell’esperimento
94°C
1’
TEMPERATURA e TEMPO di DENATURAZIONE
Emivita* Taq polimerasi: 30 min a 95°C~ 30 cicli di denaturazione di 1 min
TDEN › 95°C o N. cicli › 30
 Diminuire il tempo di denaturazione/ciclo
* Il tempo nel quale l’enzima perde il 50% di attività
TEMPERATURA e TEMPO di ANNEALING DEI PRIMERS
TANN troppo bassa 
amplificazione aspecifica
TANN troppo alta 
amplificazione con bassa resa
TANN ~ TMELTING
o
primers lunghi

60°C
30’’
Allungare il tempo
di annealing
TEMPERATURA e TEMPO di ALLUNGAMENTO
72°C
1’
TEMPERATURA: 70-72°C a seconda dell’enzima
TEMPO: 1min / Kb di amplificato (1’ si usa comunque anche per prodotti di PCR sotto 1 Kb. 1
Kb = 1000 bp)
ALLUNGAMENTO FINALE di 7-10 min per completare la sintesi degli eventuali prodotti parziali
STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ DELLA PCR: TOUCHDOWN PCR
PCR CLASSICA
Den.
iniziale
94°C
3-5 min
TOUCHDOWN PCR
1
ciclo

Den.
30 sec
94°C
Ann.
30 sec
All.
1 min/Kb
30
cicli
Tm
7 min
72°C
1
ciclo
94°C
3-5 min

Den.
30 sec
Ann.
30 sec
All.
1 min/Kb
1
ciclo
94°C
Tm(+5°C) -0.5°C/ciclo
72°C
10
cicli

72°C

All.
finale
Den.
iniziale
Den.
30 sec
Ann.
30 sec
All.
1 min/Kb
All.
finale
7 min
94°C
Tm(-5°C)
20
cicli
72°C

72°C
In sostanza nella touchdown PCR non si fanno 30 cicli tutti uguali come nella PCR standard (sinistra); al contrario durante i primi 10
cicli ad ogni ciclo lo step dell’annealing prevede di abbassare la TM di 0.5°C alla volta (destra in verde).
Ad esempio, ipotizziamo una PCR con annealing dei primer a 53°C. Nella PCR standard OGNI ciclo dei 30 avrebbe denaturazione,
poi annealing a 53°C e poi allungamento. Nella PCR touchdown il primo ciclo sarebbe con annelaing a 58°C, il secondo a 57.5°C
il terzo a 57°C il quarto a 56.5°C e via così fino al decimo ciclo che sarebbe con annealing a 53°C. A questo punto i rimanenti 20
cicli sarebbero tutti con annealing a 53°C
1
ciclo
ALTRE STRATEGIE per AUMENTARE la SPECIFICITA’ DELLA PCR
HOT START
Nella Hot Start la Taq polimerasi è modificata
e si attiva SOLO nella fase della denaturazione
Perché realizzare una PCR “hot start”?
Durante l’allestimento della reazione di PCR o durante
il riscaldamento iniziale del campione si possono
verificare situazioni di appaiamento non specifico fra
primers e stampo.
Fra 40 e 50°C la Taq polimerasi ha un’efficiente
attività polimerasica e può estendere i primers non
correttamente appaiati.
NESTED PRIMER PCR
Nella Nested Primers PCR dopo la prima PCR si
esegue una seconda PCR sui prodotti della prima PCR
usando un a coppia di primers nuova, scelta
INTERNAMENTE al prodotto di PCR


L’amplificazione è realizzata con un
set di primers
Il prodotto è riamplificato con un set di
primers interni ai precedenti
Ia PCR
5’
3’
3’
5’
3’
La PCR “hot start” previene la formazione di
questi prodotti non specifici in quanto un
componente chiave della miscela di reazione
(enzima o MgCl2) viene aggiunto dopo lo step di
denaturazione iniziale.
Enzimi “Hot start” (AmpliTaq Gold; anticorpi;
SELEX) Gocce di cera
5’
3’
5’
IIa PCR
3’
pr. nested
5’
pr. nested
3’
5’
5’
3’
3’
5’
I prodotti non specifici amplificati nella Ia PCR
non saranno amplificati nella IIa
UNA PARTICOLARITA’ dei PRODOTTI di PCR – Il TA Cloning
La Taq polimerasi e le altre polimerasi per PCR hanno una particolare attività
enzimatica che aggiunge un singolo nucleotide all’estremità 3‘dei prodotti di PCR.
In presenza dei 4 trifosfati (dNTPs) è preferenzialmente aggiunto dA.
Quindi un prodotto di PCR ha sempre una base (A) che sporge al 3’ che NON ERA
PRESENTE sullo stampo
5’
3’-A
A-3’
5’
Quindi un prodotto di PCR non ha estremità “piatte” e come tale non si può saldare a
un qualunque altro frammento (un vettore plasmidico per clonare il prodotto di PCR
ad esempio).
O meglio, è necessario usare plasmidi modificati che hanno una coppia di T che
5’
sporgono alle loro estremità
A-3’
T
3’-A
5’ T
Questa particolare procedura di clonaggio dei prodotti di PCR si chiama TA-cloning
APPLICAZIONI della PCR
• diagnostica molecolare clinica; diagnosi prenatali
• identificazione di cellule tumorali, di infezioni batteriche e
virali;
• analisi della variabilità genetica di popolazioni; analisi di
DNA antico
• analisi di campioni biologici in medicina legale: “DNA
Forense”
• analisi di campioni per controlli qualità e sicurezza alimenti
• analisi ambientali
• sequenziamento di DNA
• Clonaggio e manipolazione dei geni (adattatori, linkers,
MCS, spaziatori etc.); Mutagenesi casuale o sito-specifica;
Produzione di sonde oligonucleotidiche; analisi di
genoteche/identificazione e caratterizzazione di cloni
ricombinanti; analisi di espressione
• ………………
Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
Diagnostica Molecolare
della Anemia Falciforme
con PCR e RFLP
(Restriction Fragment
Length Polymorphism)
Snustad, Simmons – Principi di Genetica, IV Ed. – Capitolo 15
Diagnostica Molecolare della Anemia Falciforme
con PCR e RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism)
DIAGNOSTICA degli OGM negli ALIMENTI
TEST sulle PROTEINE
TEST sul DNA


Rilevazione immunologica
della proteina codificata dal
transgene (ELISA)
- Quali- / quantitativo
- Rapido
- Test da campo
- Richiede materie prime non
lavorate
- L’espressione delle proteine è
spesso tessuto-specifica e
sviluppo-dipendente
Ricerca del transgene e di
sequenze ad esso correlate
(PCR e Real-time PCR)


- Quali- / quantitativo
- Rapido
- Sensibile (limite = 0.0001%)
- Degradazione del DNA
- Presenza di inibitori della polimerasi
- Possibili contaminazioni con DNA
estraneo
- Non tutti i derivati alimentari
contengono DNA (es. olio di semi
di mais)
PROCEDURA per il RILEVAMENTO di OGM negli alimenti
mediante TEST sul DNA
I° STEP
Analisi qualitativa (screening)
Rivela la presenza/assenza dell’OGM nel campione
Si ricerca la presenza di sequenze di DNA comuni alla maggior parte degli OGM
risultato
negativo
risultato
positivo
Si identifica il transgene presente, verificando
se è uno di quelli autorizzati in commercio
L’analisi si arresta
II° STEP
Nessun transgene
autorizzato
Alimento illegale
Transgene autorizzato
Analisi quantitativa
con PCR Real Time
Se i singoli ingredienti superano la
percentuale dell’1% scatta l’obbligo
di riportarne la presenza in etichetta
GENI BERSAGLIO nell’analisi qualitativa degli alimenti
Elementi caratteristici dei costrutti ricombinanti (i transgeni)
Promotore
CaMV 35S
Transgene
tNOS
Gene
marcatore
Promotore
CaMV 35S
Amplificazione di una delle seguenti sequenze:
tNOS*
Gene
marcatore
PCR QUALITATIVA
Amplificazione di geni sicuramente presenti nel campione
(es. lectina della soia, zeina del mais)
Individuazione del transgene
(è disponibile una banca dati che contiene tutte le sequenze
di DNA depositate nei brevetti a livello mondiale)
PCR QUANTITATIVA
* Terminatore del gene della Nopalina sintetasi
REAL-TIME PCR
Amplificazione sequenza bersaglio
+
quantificazione dell’espressione genica
 identificazione del prodotto di amplificazione specifico
rispetto a prodotti aspecifici (in alcuni sistemi)
 analisi simultanea di due (o più) campioni nella stessa

reazione
individuazione di mutazioni puntiformi
… on-line e in tempo reale!
2 ESEMPI di QUANTIFICAZIONE...
Mais Bt
Il mais-BT è stato reso resistente
alla piralide mediante l’inserimento
di un gene che codifica per una tossina insetticida
derivata dal batterio Bacillus
turingiensis la cui ingestione
provoca la morte delle larve
paralizzandone l’intestino.
Soia Roundup Ready
La soia Roundup Ready (Monsanto) è
stata modificata geneticamente per
resistere alla somministrazione del
glifosato, un diserbante ad ampio
spettro.
Per quantificare mais e soia transgenici negli alimenti sono state opportunamente
disegnate combinazioni di Sonde di Ibridazione che riconoscono tanto il transgene
quanto un gene endogeno, rendendo possibile quantificare simultaneamente sia il
contenuto di mais/soia GM che di mais/soia totale nel campione in analisi.
Sonda 1 specifica per il transgene
cryIA(b) (Endotossina delta),
codificante per la tossina
Sonda 2 specifica per il gene endogeno
codificante per l’enzima invertasi
Sonda 1 specifica per il transgene
CP4-EPSPS (5-Enol-pyruvylshikimate-3phosphate synthase from Agrobacterium
sp. CP4)
Sonda 2 specifica per il gene endogeno
codificante per la lectina