Diagnosi molecolare di patologia genetica

Scopi della analisi molecolare
• Conferma della diagnosi clinica
nei pazienti affetti
• Ricerca dei portatori sani
• Diagnosi prenatale
Patologia Genetica
• Patologia Monogenica:
– malattie dovute a mutazioni di un singolo gene
• Patologia Poligenica:
– malattie dovute a mutazioni di più geni,
generalmente con presenza di una componente
ambientale
• Patologia Cromosomica:
– malattie dovute ad alterazioni numeriche o
strutturali del cariotipo
Il cariotipo: una sola analisi
per diverse patologie
Analisi molecolare:
una analisi specifica
per una specifica patologia
Tutto inizia dal DNA
• Molecola depositaria del
patrimonio genetico
• Trasporta l' informazione
genetica necessaria alla
trasmissione dei caratteri
ereditari
http://learn.genetics.utah.edu/
Campioni da cui si può
estrarre DNA
• Una goccia di sangue
• Saliva presente su una sigaretta o su un
chewing-gum
• Tracce di sperma
• Urine e feci
• Un capello
• Fossili
• Mummie
Estrazione di DNA
• Varie metodiche per
estrazione DNA
• Estrazione manuale:
vari kit in commercio
( spin basket, biglie
magnetiche)
• Estrattori automatici
Estrazione Dna da sangue mediante
Kit commerciali
Campione di sangue in EDTA
Aliquotare 200μl di Binding Buffer
Aggiungere 40 μl di proteinasi K
Vortexare ed incubare per 10 min a 72° C in termoblocco
Spinnare
Aggiungere 100μl di isopropanolo
Assemblare il filtro High Pure con una provetta relativa
Pipettare il campione nel serbatoio superiore e centrifugare per
1 min
 Successivi lavaggi con Inibitor Remaval e con Wash Buffer
 Aggiungere 200μl di Elution Buffer
 Centrifugare per 1 min e raccogliere il DNA








Reazione a catena della polimerasi
(PCR)
• Mezzo rapido ed economico per ottenere
grandi quantità (amplificazione) di una
specifica sequenza di DNA o RNA
• Sfrutta la capacità della polimerasi di
catalizzare la sintesi di acidi nucleici a partire
da un filamento stampo
PCR: 3 Fasi
• Denaturazione :
apertura doppia elica
• Annealing : attacco
dei primers
• Extension : copiatura
da parte della Taq
polimerasi
Reazione di Polimerizzazione a
Catena (PCR)
Reagenti necessari per la PCR
•
•
•
•
•
•
DNA
Primers
Oligonucleotidi
Taq polimerasi
Baffer e Magnesio
H2O
Ciclo standard di PCR
94°C 10 m
1 ciclo
94°C 30s
58°C 30s
72°C 30s
35 cicli
72°C 10 m
1 ciclo
Preparazione di una PCR
http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
Verifica prodotti di PCR mediante
elettroforesi di acidi nucleici
• Migrazione di ioni o molecole sottoposte ad un
campo elettrico applicato
• Permette di separare i frammenti amplificati
mediante PCR
Elettroforesi su gel
• Si preparano i gel di agarosio che costituiscono una
“matrice a setaccio”
• Ad un’estremità del gel vengono “caricati” i campioni
da analizzare e viene applicato un campo elettrico
• La direzione di migrazione dipende dalla carica delle
molecole: gli acidi nucleici, carichi negativamente,
migreranno verso il polo positivo
• La velocità di migrazione dipende dalla dimensione del
frammento di acido nucleico
• Si ottiene quindi la separazione dei frammenti di DNA
o RNA esclusivamente sulla base delle loro dimensioni
(peso molecolare)
Sequenziamento diretto
del DNA
• Metodo accurato per ottenere
informazioni precise e definitive su un
gene
• Metodo ideale per la rilevazione di
mutazioni difficilmente evidenziabili e di
mutazioni puntiformi
Sequenza di DNA
Mutazione in eterozigosi
MUTAZIONE IN OMOZIGOSI
Analisi di frammenti
• Riconoscimento di paternità
• Identificazione di autori di
reati
• Identificazione di vittime di
reati o sinistri