LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR

LA REAZIONE A CATENA
DELLA POLIMERASI
PCR
INTRODUZIONE
• Tecnica ideata da Mullis
collaboratori nel 1984
e
• La possibilita' di disporre di
quantità virtualmente illimitate
di un determinato frammento di
DNA, anche quando il materiale
di partenza e' estremamente
esiguo
o
danneggiato
da
processi di degradazione, ha
fatto di questo procedimento
una delle scoperte più importanti
nel
campo
della
Biologia
Molecolare
LA REAZIONE
La PCR e' un metodo che permette di amplificare
selettivamente in vitro, mediante una reazione a
catena, sequenze stabilite di DNA o RNA di
dimensioni fino a circa duemila paia di nucleotidi
(basi), caratterizzandosi, quindi, per elevata
specificita' anche nei casi in cui siano presenti
molecole estranee a quelle d'interesse.
La reazione a catena della polimerasi si
basa sul principio naturale della
replicazione del DNA
REPLICAZIONE
• Reazione di polimerizzazione
• Reagenti: dATP, dCTP, dGTP, dTTP
• Necessaria la presenza di un DNA a
singolo
filamento
fungente
da
stampo
• Reazione
catalizzata
dalla
DNA
polimerasi
• Reazione semiconservativa
DNA POLIMERASI
• Enzimi capaci di costruire una nuova
catena nel verso 5’-3’
• Individuati da Arthur Kornberg nel 1958
• Non possono iniziare ma solo allungare un
filamento polinucleotidico preesistente
(innesco)
DIREZIONE DELLA
REPLICAZIONE
I nuovi filamenti vengono sempre sintetizzati
in direzione 3' => 5'. Il 5' trifosfato può
essere aggiunto solo ad un 3'OH del
desossiribosio.
PCR
• Permette di verificare la presenza di una
determinata sequenza nucleotidica nel
DNA
genomico
di
un
organismo,
amplificando la sequenza selettivamente e
con enorme efficienza
• Permette di simulare la replicazione
“generazionale” di DNA per le sequenze
geniche scelte
FASI DEL
PROCESSO DI
AMPLIFICAZIONE
•Il processo di amplificazione
è ripetitivo
•Per ogni ciclo vi sono una
serie di passaggi successivi
1° FASE:
DENATURAZIONE
TERMICA
• La temperatura del mezzo viene
portata a un valore tale da provocare
la
separazione
delle
catene
complementari del DNA contenente la
sequenza bersaglio (T>90°C)
Denaturazione
2° FASE:
IBRIDAZIONE o ANNEALING
• La
temperatura
viene
opportunamente abbassata per far
si che le molecole a singolo
filamento formatesi nella prima
fase,
possano
formare
un
complesso sufficientemente stabile
con i primers
2° FASE:
IBRIDAZIONE o ANNEALING
Calcolo della Temperatura di annealing
C-G = 4°C
A-T = 2°C
A) 5’-GCGTTAGGCCAGCGGG-3’
B) 5’-CCATTTGAAATTTATA-3’
C) 5’-AGGTCCCCATCAGCGC-3’
Tm = 56°C
Tm = 38°C
Tm = 54°C
Annealing
3° FASE:
ESTENSIONE
• Una
DNA
polimerasi
catalizza
l’estensione del primer che deve
necessariamente formare un tratto a
doppio
filamento
col
DNA,
in
direzione 5’-3’
Estensione
Velocità di incorporamento ~ 20 nucleotidi /sec
II Cycle
III Cycle
IV Cycle
V Cycle
Graphic
DNA thermal cyclers
T gradient
EFFICIENZA
DELL’AMPLIFICAZIONE
• L’accumulo esponenziale dei prodotti
di amplificazione non è un processo
illimitato
• Dopo un certo numero di cicli di
amplificazione si raggiunge un livello
di “plateau”
Polymerase Chain Reaction
Reazioni più comunemente usate nel laboratorio
diagnostico
• PCR singola
• PCR nested
• PCR multiplex
• RT-PCR
• Q-PCR (real time PCR)
nested PCR
Primer 1.1
1st Round PCR
Primer 1.2
Primer 2.2
2nd Round PCR
Primer 2.2
Amplification product
nested PCR
Vantaggi
• elevata specificità e efficienza
• prodotto
dell’amplificazione
facilmente
evidenziato dopo elettroforesi su gel di
agarosio
Svantaggi
• elevato rischio di falsi positivi
PCR multiplex
Identificazione di virus differenti in una sola reazione
Duplex PCR per
polyomavirus umani
BK e JC
RT-PCR
Trascrittasi inverse
• virus della mieloblastosi aviaria (AMV)
• virus della Leucemia Murina di Moloney (M-MLV)
• Tth DNA-polimerasi -attività di trascrittasi inversa
- attività di DNA polimerasi
Amplificazione
• RNA virale genomico
• mRNA virali
Tecniche molecolari
Elevata sensibilità e specificità
Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili
vantaggi
Identificazione e tipizzazione
Quantificazione del carico virale
Facile automazione
Rapidità di esecuzione
Rischio di contaminazioni  falsi positivi
limiti
Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici
non specifici
Rischio di falsi negativi per inibitori
Alti costi