LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR
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LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI PCR INTRODUZIONE • Tecnica ideata da Mullis collaboratori nel 1984 e • La possibilita' di disporre di quantità virtualmente illimitate di un determinato frammento di DNA, anche quando il materiale di partenza e' estremamente esiguo o danneggiato da processi di degradazione, ha fatto di questo procedimento una delle scoperte più importanti nel campo della Biologia Molecolare LA REAZIONE La PCR e' un metodo che permette di amplificare selettivamente in vitro, mediante una reazione a catena, sequenze stabilite di DNA o RNA di dimensioni fino a circa duemila paia di nucleotidi (basi), caratterizzandosi, quindi, per elevata specificita' anche nei casi in cui siano presenti molecole estranee a quelle d'interesse. La reazione a catena della polimerasi si basa sul principio naturale della replicazione del DNA REPLICAZIONE • Reazione di polimerizzazione • Reagenti: dATP, dCTP, dGTP, dTTP • Necessaria la presenza di un DNA a singolo filamento fungente da stampo • Reazione catalizzata dalla DNA polimerasi • Reazione semiconservativa DNA POLIMERASI • Enzimi capaci di costruire una nuova catena nel verso 5’-3’ • Individuati da Arthur Kornberg nel 1958 • Non possono iniziare ma solo allungare un filamento polinucleotidico preesistente (innesco) DIREZIONE DELLA REPLICAZIONE I nuovi filamenti vengono sempre sintetizzati in direzione 3' => 5'. Il 5' trifosfato può essere aggiunto solo ad un 3'OH del desossiribosio. PCR • Permette di verificare la presenza di una determinata sequenza nucleotidica nel DNA genomico di un organismo, amplificando la sequenza selettivamente e con enorme efficienza • Permette di simulare la replicazione “generazionale” di DNA per le sequenze geniche scelte FASI DEL PROCESSO DI AMPLIFICAZIONE •Il processo di amplificazione è ripetitivo •Per ogni ciclo vi sono una serie di passaggi successivi 1° FASE: DENATURAZIONE TERMICA • La temperatura del mezzo viene portata a un valore tale da provocare la separazione delle catene complementari del DNA contenente la sequenza bersaglio (T>90°C) Denaturazione 2° FASE: IBRIDAZIONE o ANNEALING • La temperatura viene opportunamente abbassata per far si che le molecole a singolo filamento formatesi nella prima fase, possano formare un complesso sufficientemente stabile con i primers 2° FASE: IBRIDAZIONE o ANNEALING Calcolo della Temperatura di annealing C-G = 4°C A-T = 2°C A) 5’-GCGTTAGGCCAGCGGG-3’ B) 5’-CCATTTGAAATTTATA-3’ C) 5’-AGGTCCCCATCAGCGC-3’ Tm = 56°C Tm = 38°C Tm = 54°C Annealing 3° FASE: ESTENSIONE • Una DNA polimerasi catalizza l’estensione del primer che deve necessariamente formare un tratto a doppio filamento col DNA, in direzione 5’-3’ Estensione Velocità di incorporamento ~ 20 nucleotidi /sec II Cycle III Cycle IV Cycle V Cycle Graphic DNA thermal cyclers T gradient EFFICIENZA DELL’AMPLIFICAZIONE • L’accumulo esponenziale dei prodotti di amplificazione non è un processo illimitato • Dopo un certo numero di cicli di amplificazione si raggiunge un livello di “plateau” Polymerase Chain Reaction Reazioni più comunemente usate nel laboratorio diagnostico • PCR singola • PCR nested • PCR multiplex • RT-PCR • Q-PCR (real time PCR) nested PCR Primer 1.1 1st Round PCR Primer 1.2 Primer 2.2 2nd Round PCR Primer 2.2 Amplification product nested PCR Vantaggi • elevata specificità e efficienza • prodotto dell’amplificazione facilmente evidenziato dopo elettroforesi su gel di agarosio Svantaggi • elevato rischio di falsi positivi PCR multiplex Identificazione di virus differenti in una sola reazione Duplex PCR per polyomavirus umani BK e JC RT-PCR Trascrittasi inverse • virus della mieloblastosi aviaria (AMV) • virus della Leucemia Murina di Moloney (M-MLV) • Tth DNA-polimerasi -attività di trascrittasi inversa - attività di DNA polimerasi Amplificazione • RNA virale genomico • mRNA virali Tecniche molecolari Elevata sensibilità e specificità Ricerca di virus difficilmente o non coltivabili vantaggi Identificazione e tipizzazione Quantificazione del carico virale Facile automazione Rapidità di esecuzione Rischio di contaminazioni falsi positivi limiti Rischio di cross-reazioni con acidi nucleici non specifici Rischio di falsi negativi per inibitori Alti costi
![mutazioni genetiche [al DNA] effetti evolutivi [fetali] effetti tardivi](http://s1.studylibit.com/store/data/004205334_1-d8ada56ee9f5184276979f04a9a248a9-300x300.png)
