BIOCHIMICA-I
I anno (secondo semestre)
Prof. Chiarugi, Camici, Liguri, Raugei
Struttura e funzione delle principali biomolecole.
Carboidrati: monosaccaridi, disaccaridi, e polisaccaridi e le loro implicazioni nella biochimica
umana.
Lipidi: le principali classi di lipidi e le loro implicazioni nella biochimica umana.
Gli amminoacidi. Classificazione e descrizione dei venti alfa-L-amminoacidi che costituiscono le
proteine. Amminoacidi essenziali. Altri amminoacidi di importanza metabolica.
Le proteine. Funzioni svolte dalle proteine nell’organismo umano. La struttura delle proteine. Il
legame peptidico. Sequenza amminoacidica. Struttura secondaria e descrizione di alfa-elica,
foglietto-beta e ripiegamenti-beta. Motivi strutturali. Struttura terziaria. Forze che stabilizzano la
struttura tridimensionale delle proteine. Domini strutturali. Struttura quaternaria. Proteine globulari
e proteine fibrose. Le alfa-cheratine e la fibroina della seta. Metodi di studio della struttura
tridimensionale delle proteine: cristallografia a raggi X e risonanza magnetica nucleare.
Il folding delle proteine. Fattori che determinano la velocità di folding. Le chaperonine. Il
misfolding delle proteine. Aggregazione proteica, formazione di fibrille amiloidi e basi molecolari
di malattie degenerative umane. Le serpine e la patologia associata a deficit di a1-antitripsina.
Modificazioni post-traduzionali delle proteine: glicosilazione e fosforilazione. Àncore lipidiche.
Peptidi segnale. Traffico intracellulare delle proteine. Degradazione delle proteine. Sistema di
ubiquitinazione. Il proteasoma.
Proteine coniugate di interesse biochimico. Le lipoproteine plasmatiche. Classificazione delle
lipoproteine in base alla densità e alla migrazione elettroforetica. Le apolipoproteine. Chilomicroni:
struttura, funzione e destino. VLDL: struttura, funzione e destino. LDL struttura, funzione e destino.
Sistemi di endocitosi dipendenti da clatrina. HDL: struttura e funzione.
Proteine del tessuto connettivo. Il collagene: tripla elica, prolina-idrossiprolina (ruolo della
vitamina C), allilisina, legami crociati. Malattie del collagene: rachitismo, scorbuto, sindrome di
Marfau, placche aterosclerotiche. L’elastina. I proteoglicani.
Le globine. Struttura della mioglobina e dell’emoglobina; rapporti tra struttura e funzione.
ENZIMOLOGIA
Generalità sugli enzimi: attività catalitica e struttura; cofattori e gruppi prostetici; oloenzima ed
apoenzima. Specificità di azione. Cinetica chimica e termodinamica. Formazione del complesso
enzima-substrato. Caratteristiche del sito attivo. La cinetica enzimatica. Modello di Michaelis e
Menten. Valori di Km e Vmax. Unità di misura dell’attività enzimatica. Reazioni enzimatiche
reversibili. Effetto del pH e della temperatura. Inibizione competitiva, non competitiva e
irreversibile. Farmaci come inibitori enzimatici.
Meccanismi della catalisi enzimatica. Catalisi acido-base. Catalisi covalente. Meccanismo
d’azione del Lisozima e della Chimotripsina. Complessi multienzimatici: la piruvato deidrogenasi.
Regolazione enzimatica. Allosterismo e cooperatività. Cinetica delgi enzimi allosterici.
Cooperatività: modello concertato e modello sequenziale. Regolazione covalente: reversibile ed
irreversibile. Amplificazione di segnale: la coagulazione del sangue. Compartimentazione.
Controllo del livello intracellulare degli enzimi.
Azione biochimica delle vitamine. Le vitamine utilizzate nelle vie metaboliche. Vitamine
idrosolubili e liposolubili. Fabbisogno e carenze vitaminiche. I coenzimi: struttura e funzioni.
Coenzimi flavinici e pirimi dinici. Acido folico e coenzimi. Tiamina. Acido lipoico. Biotina.
Coenzima A. I coenzimi della piridossina. I coenzimi della Vitamina B12.
Classificazione degli enzimi. Ossidoreduttasi. Transferasi. Idrolasi. Liasi. Isomerasi e ligasi.
METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Preparazione ed analisi di miscele di aminoacidi, idrolisati proteici, cromatografia, reazioni con la
ninidrina. Generalità sulle tecniche di purificazione delle proteine. Determinazione della struttura
primaria delle proteine, terminali amminici e carbossilici. Subframmentazione chimica ed
enzimatica. Degradazione di Edman. Informazioni tratte dalla struttura primaria di una proteina.
Elettroforesi. Velocità di migrazione di una molecola carica. SDS-PAGE. Elettroforesi
bidimensionale. Elettroforesi su agarosio di DNA ed RNA.
La purificazione delle proteine. Cromatografia: scambio ionico, gel-filtrazione e cromatografia di
affinità..
I dosaggi enzimatici: teoria ed applicazioni. Dosaggi in continuo. Principi di spettrofotometria.
Tecniche immunoenzimatiche. ELISA. Western blot. Immunostaining. Cenni sulle applicazioni
cliniche.
BIOLOGIA MOLECOLARE E BIOTECNOLOGIE
Basi molecolari dell’informazione ereditaria: struttura dei nucleotidi e della catena degli acidi
nucleici. DNAsi. Endonucleasi di restrizione. Struttura della doppia elica del DNA. Il
superavvolgimento del DNA: le topoisomerasi.
Le DNA polimerasi: attività enzimatiche. Meccanismo della replicazione del DNA e di controllo
della fedeltà di copia. Il "proof reading" e meccanismi di correzione degli errori. Correlazioni con
patologie umane, con l’invecchiamento e con le neoplasie.
Telomerasi.
Varie cause di mutazioni: forme tautomeriche delle basi, mutageni che modificano chimicamente
il DNA, intercalanti, analoghi di basi.
Trascrizione e maturazione degli RNA. RNA polimerasi e meccanismo della trascrizione e della
terminazione. Differenze tra procarioti ed eucarioti. Modificazioni post-trascrizionali: aggiunta del
CAP, poliadenilazione e splicing. Meccanismi di splicing alternativo.
Controllo della espressione genica: struttura dei promotori procariotici ed eucariotici. Enhancers.
Esempio degli operoni lattosio e triptofano. Meccanismo di regolazione genica da parte di ormoni
steroidei. Struttura di un promotore eucariotico: il gene della metallotioneina.
Esperimento di clonaggio di un cDNA e di produzione di una proteina eterologa in batteri.
Gli anticorpi: struttura della immunoglobulina e caratteristiche delle varie porzioni. Origine della
diversità anticorpale.
Il processo traduzionale.Codice genetico e sue proprietà;. Gli RNA transfert ed i ribosomali. Le
aminoacil-tRNA sintetasi. Formazione del complesso di inizio. Le fasi di allungamento e
terminazione. La fedeltà della traduzione. Meccanismi di correzione degli errori. Destino posttraduzionale delle proteine.
Membrane cellulari e trasporto transmembrana. Fosfolipidi di membrana. Proteine di
membrana. Asimmetria del plasmalemma. La membrana eritrocitaria. Spettrina e glicoforina.
Trasporto trasnmembrana: classificazione. Permeabilità selettiva. Trasporto passivo. Legge di Fick
e trasporto attivo. Le ATPasi. Modello molecolare della Na+/K+ ATPasi. Termodinamica del
trasporto. Trasporto attivo per trasferimento di gruppo. Trasporto attivo del glucosio. Ciclo del
glutatione.
Biotecnologie:
Estrazione del RNA messaggero e sintesi del cDNA. Analisi di una libreria di cDNA tramite
oligonucleotidi degenerati. Il Southern blot. Il Northern blot.
Vettori di espressione batterici. Purificazione di proteine ricombinanti in batteri, proteine di
fusione. Utilità della espres sione di proteine eterologhe in microorganismi e suoi svantaggi. Esempi
di espressione in batteri di proteine semplici (insulina, ormone della crescita, attivatore del
plasminogeno, vaccino contro la meningite). La mutagenesi in vitro e l' esempio del vaccino per la
pertosse. Vettori shuttle per espressione in cellule di mammifero in coltura. Trasfezione ed
espressione di proteine complesse in cellule di mammifero in coltura.
Gli anticorpi monoclonali. Modalità di selezione degli ibridom.i. Umanizzazione degli anticorpi e
loro utilizzazione nella terapia antitumorale. .
La tecnica della PCR. Esempi di applicazione nella diagnosi di malattie infettive, di tumori e di
malattie genetiche.
Progetto genoma
Tecnica enzimatica (Sanger) di sequenziamento del DNA.
Oligonucleotidi antisenso come possibili agenti antivirali e antitumorali.
