enzimi - Corso di Laurea in Infermieristica
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ENZIMI Gli ENZIMI sono proteine (eccezioni: RIBOZIMI = RNA con attività catalitica) che sono strutturalmente suddivise in due classi: • PROTEINE SEMPLICI (costituite solo dalla parte di natura proteica) • PROTEINE CONIUGATE (costituite da una parte proteica e da una di natura non proteica) IONI ESSENZIALI ATTIVATORI COSTITUTIVI COFATTORI COENZIMI CO-SUBSTRATI GRUPPI PROSTETICI Cofattori Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché un enzima sia attivo • GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima Gli ENZIMI sono costituiti da molecole di natura proteica (eccezioni: RIBOZIMI= RNA con attività catalitica) e possono essere suddivisi in due classi: • PROTEINE SEMPLICI • PROTEINE CONIUGATE Oloenzima: complesso cataliticamente attivo enzima-cofattore Apoenzima: la parte proteica,priva di cofattore, cataliticamente inattiva Cofattore: componente non proteica (IONE METALLICO o MOLECOLA ORGANICA) Dal punto di vista strutturale gli enzimi possono essere distinti in: • MONOMERICI • OLIGOMERICI • COMPLESSI ENZIMATICI IONI ESSENZIALI ATTIVATORI COSTITUTIVI COFATTORI COENZIMI CO-SUBSTRATI GRUPPI PROSTETICI Cofattori Piccole molecole organiche o inorganiche la cui presenza è necessaria perché un enzima sia attivo • In genere TERMOSTABILI, mentre la maggior parte degli enzimi perde l’attività in seguito a riscaldamento • Funzionano in genere da trasportatori intermedi di gruppi funzionali, di atomi specifici o di elettroni che vengono trasferiti nella reazione enzimatica generale • GRUPPO PROSTETICO se legato molto saldamente all’apoenzima GLI ENZIMI SONO PROTEINE!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! Alcuni enzimi che contengono o richiedono come cofattori elementi inorganici Zn2+ Alcool deidrogenasi Anidrasi carbonica carbossipeptidasi Fe2+ o Fe3+ Citocromi Catalasi Perossidasi Mg2+ Esochinasi Glucosio-6-fosfatasi Piruvato chinasi Mn2+ Arginasi Ribonucleotide reduttasi Cu2+ Citocromo ossidasi Tirosinasi K+ Piruvato chinasi Na+ ATPasi della membrana plasmatica Ni2+ Ureasi Mo Xantina ossidasi Se Glutatione perossidasi N.B. Effetti tossici di alcuni metalli pesanti (Cd2+ e Hg2+ possono sostituire lo ione Zn2+ nel sito attivo di alcuni enzimi, rendendoli inattivi) VITAMINE IDROSOLUBILI DENOMINAZIONE FABBISOGNO CARENZA COENZIMA FUNZIONE B1 TIAMINA 1.5 mg beri-beri TPP Decarbossilazione B2 RIBOFLAVINA 1.5 mg Dermatite, Cheilosi FMN, FAD Redox PP NICOTINAMIDE 10 mg Pellagra NAD, NADP Redox B5 Ac. PANTOTENICO 10 mg Affaticamento HSCoA Trasporto acili B6 PIRIDOSSALE 2 mg Anemia microcitica Dermatite, Nevrite PLP Metabolismo Aa, Sintesi EME B10 Ac. FOLICO 0.4 mg Anemia macro. megaloblastica FH4 Metab. Unità monoCarboniose B12 COBALAMINA 5 µg Anemia perniciosa Adenosil B12 Metil B12 Isomerizzazione, Metilazione C Ac. ASCORBICO 60 mg Scorbuto H BIOTINA 0.3mg Affaticamento, Depressione, Dermatite Redox Biocitina Carbossilazione Classificazione Ø Ossidoriduttasi : reazioni di ossidoriduzione Ø Transferasi : trasferimento di un raggruppamento chimico (carbossile, acile, amminico, fosforico, etc.) Ø Idrolasi : reazioni idrolitiche Ø Liasi : rottura non idrolitica e, in molti casi, formazione di legami covalenti C-C, C-N, C-S (decarbossilasi, aldolasi, etc.) Ø Isomerasi : riorganizzazioni intramolecolari (reazioni monomolecolari) Ø Ligasi : formazione di legami covalenti in reazioni fortemente endoergoniche, che avvengono grazie all’utilizzo di ATP (sintetasi, carbossilasi, etc.) Gli enzimi: catalizzatori biologici - La catalisi è necessaria per permettere a molte reazioni biochimiche essenziali di procedere ad una velocità compatibile con le esigenze fisiologiche in condizioni di temperatura e pH molto blande - Gli enzimi aumentano la velocità di una reazione chimica senza subire trasformazioni durante l’intero processo - Gli enzimi non influiscono sulla posizione dell‘equilibrio di una reazione - Un processo termodinamicamente favorito non viene reso più favorito, né un processo sfavorito viene reso favorito, dalla presenza di un catalizzatore LO STATO DI EQUILIBRIO VIENE SOLO RAGGIUNTO PIU’ VELOCEMENTE AUMENTANO LA VELOCITA’ DI REAZIONE ABBASSANDO L’ENERGIA DI ATTIVAZIONE Velocità di una reazione Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso, nell’unità di tempo A B d[A] d[B] v= =dt dt Velocità di una reazione irreversibile di primo ordine Quantità del prodotto formatosi, o del substrato scomparso, nell’unità di tempo A B d[A] d[B] v== dt dt Il ΔG è utile per comprendere il funzionamento degli enzimi • L’energia libera (G) è una funzione termodinamica che rappresenta una misura dell’energia utile, cioè dell’energia in grado di compiere un lavoro • L’equilibrio della reazione dipende da ΔG° ΔG° <0 spontanea • La velocità di reazione dipende dalla barriera energetica ΔG‡ : l’energia di attivazione Affinché una reazione chimica abbia luogo: A --à B ΔG° negativo GA > GB reazione esoergonica 1. I reagenti devono entrare in collisione 2. La collisione deve avvenire con un orientamento corretto 3. I reagenti devono avere energia sufficiente per poter reagire 4. ENERGIA DI ATTIVAZIONE energia libera supplementare che le molecole devono possedere per raggiungere una condizione reattiva nota come stato di transizione Energia di attivazione Gli enzimi catalizzano le reazioni abbassando la barriera di attivazione piuttosto che aumentando l’energia media dei reagenti. Essi legano saldamente gli intermedi allo stato di transizione e l’energia di legame di questa interazione riduce l’ ENERGIA DI ATTIVAZIONE. Enzimi SITO ATTIVO Sito di legame (microambiente tridimensionale della struttura della proteina dove vi è l’interazione con il substrato) Sito catalitico (porzione limitata del sito attivo costituito dagli aminoacidi coinvolti direttamente nella reazione enzimatica) Specificità di reazione Le molecole non devono incontrarsi casualmente ma vengono ospitate nel sito attivo e quindi il loro incontro è facilitato inoltre vengono a confrontarsi in una posizione utile (corretto orientamento). Meccanismo catalisi enzimatica Le interazioni deboli sono ottimali allo stato di transizione della reazione; i siti attivi non sono complementari al substrato come tale, ma allo stato di transizione che il substrato deve raggiungere per convertirsi in prodotto Cosa fa l’enzima ? - forma il complesso ENZIMA-SUBSTRATO (ES) abbassa il livello energetico dello STATO DI TRANSIZIONE - diminuisce quindi l’ ENERGIA DI ATTIVAZIONE - aumenta la velocità della reazione aumentando la frazione di molecole che hanno sufficiente energia per raggiungere lo stato di transizione Ø In mancanza di enzima solo una piccola proporzione di molecole possiede un’energia sufficiente a raggiungere lo stato di transizione Ø La velocità di una reazione dipende dal numero di molecole che possono raggiungere lo stato di transizione Ø In genere, quanto più è bassa l’energia di attivazione, tanti più numerose saranno le molecole dotate di un’energia sufficiente e, quindi, tanto più veloce sarà la reazione. Gli enzimi aumentano la velocità di reazione abbassando l’energia di attivazione, senza modificare lo stato energetico finale dei reagenti e dei prodotti e, quindi, l’equilibrio della reazione Proprietà degli enzimi • • • • • • Siti attivi Efficienza catalitica Specificità Cofattori Regolazione Compartimentazione Modello serratura e chiave Modello dell’adattamento indotto Un enzima lega due reagenti assicurando un corretto orientamento reciproco e la loro vicinanza. Li unisce inoltre più saldamente nello stato di transizione. Effetto della temperatura sulla velocità di una reazione enzimatica Effetto del pH sulla velocità di una reazione enzimatica • Ionizzazione del sito attivo • Denaturazione dell’enzima • pH ottimale Equazione di Michaelis-Menten v0 = Vmax [S] Km + [S] N.B. La velocità di una reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima La costante di Michaelis (KM) kM kM kM kM kM kM kM affinità Quindi la KM è la concentrazione del substrato alla quale la metà dei siti per il substrato sono saturati. Quindi KM fornisce una misura della conc di substrato richiesta affinchè la catalisi abbia luogo • Il valore di Km caratterizza l’interazione di un enzima con un dato substrato • Molti enzimi hanno valori di Km vicini alle concentrazioni fisiologiche dei loro substrati PERCHE’???? La dipendenza della velocità dalla concentrazione del substrato e quindi il controllo che il substrato può esercitare sulla velocità di reazione verrà esercitato soltanto se la concentrazione del substrato cade in quel range in cui la cinetica si approssima al I ORDINE Effetto della concentrazione del substrato sulla velocità di una reazione enzimatica Trasformazione di Lineweaver-Burk Vmax ⋅[S] v0 = K M + [S] Y 1 K M + [S] = v 0 Vmax ⋅ [S] 1 KM [S] = + v 0 Vmax ⋅ [S] Vmax ⋅ [S] 1 KM 1 1 = ⋅ + v 0 Vmax [S] Vmax X equazione di una retta: y = ax + b Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche 1 KM 1 1 = ⋅ + v0 Vmax [S] Vmax 1/v0 1/Vmax -1/KM 1/[S] Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche Grafico di Lineweaver-Burk V0 1/V0 Vmax Vmax/2 1/Vmax KM [S] -1/KM 1/[S] Grafico di Lineweaver-Burke (o dei doppi reciproci) Vmax [S] v0 = 1 v0 Km + [S] = Km + [S] Vmax [S] GLI ENZIMI REGOLATORI modulazione dell’attività quantità di proteina enzimatica regolazione Regolazione dell'attività enzimatica Controllo a livello di substrato • • Da concentrazione di substrato Inibizione da prodotto Interazione con ligandi • • • Cooperatività di legame Regolazione allosterica Associazione-dissociazione Regolazione a breve termine Modifica covalente • • • • • Fosforilazione Acetilazione Adenilazione Metilazione Proteolisi Induzione Repressione Turnover Regolazione a lungo termine (variazione della concentrazione dell’enzima) ENZIMI REGOLATORI • Gli enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore). • In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima regolatore. Vi sono due classi di enzimi regolatori: • Enzimi allosterici che agiscono mediante il legame reversibile di un metabolita chiamato modulatore • Enzimi regolati mediante modificazioni covalenti reversibili La regolazione dell’attività enzimatica Gli enzimi allosterici sono regolati da molecole chiamate effettori (o modulatori), che si legano in modo non covalente in un sito diverso da quello attivo. Quando il substrato è esso stesso un effettore, si dice omotropico. Quando l’effettore omotropico è positivo, i siti di legame funzionano in modo cooperativo e la curva tra velocità iniziale e concentrazione di substrato è sigmoidale. La regolazione dell’attività enzimatica Un esempio di regolazione allosterica da parte di un effettore eterotropico negativo: l’inibizione retroattiva di una via metabolica. La regolazione dell’attività enzimatica Regolazione da modifica covalente: fosforilazione e defosforilazione ISOENZIMI Si definiscono isoenzimi (o isozimi) quegli enzimi che catalizzano la stessa reazione, ma hanno differente sequenza primaria. Molti isoenzimi contengono subunità diverse in varie combinazioni. Organi (e tessuti) differenti spesso contengono isoenzimi differenti INIBIZIONI ENZIMATICHE 1. Gli inibitori enzimatici sono molecole che interferiscono con la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni catalizzate da enzimi. Sono tra i più importanti Agenti Farmaceutici conosciuti (es. ACIDO ACETILSALICILICO inibisce l’enzima che catalizza la prima reazione della sintesi delle prostaglandine). 2. Lo studio degli inibitori enzimatici ha fornito importanti informazioni sul MECCANISMO DI CATALISI ENZIMATICA ed ha aiutato a definire le singole reazioni di alcune vie metaboliche. Vi sono due grandi classi di INIBITORI ENZIMATICI: a. b. REVERSIBILI (rapida dissociazione del complesso EI) IRREVERSIBILI (si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima che è essenziale per la sua attività catalitica, diminuendo così la quantità assoluta di enzima libero) Inibizione competitiva (I si lega solo a E) Un inibitore competitivo diminuisce la velocità di catalisi diminuendo il numero di molecole enzimatiche disponibili per legare il substrato in quanto competono per lo stesso sito di legame sull’enzima P • Diminuisce la vo (vo = k2 [ES]) • La vmax resta inalterata (vmax = k2[Et]) • Aumenta la Km ed il nuovo valore è generalmente detta Km apparente Inibizione incompetitiva o acompetitiva (I si lega solo a ES) L’inibitore incompetitivo si lega ad un sito diverso da quello del substrato, presente solo nel complesso ES vmax vo +I + 2I P Km [S] • Diminuisce la vo (vo = k2 [ES]) • Diminuisce la vmax (vmax = k2[Et]) • Diminuisce la Km INIBIZIONE IRREVERSIBILE • Gli inibitori irreversibili sono quelli che si combinano o che distruggono un gruppo funzionale dell’enzima che è essenziale per la sua attività catalitica o che formano un’associazione non covalente particolarmente stabile. Es. 1. azione dei gas nervini sull’acetilcolinesterasi 2. inibizione irreversibile della chimotripsina Diisopropilfluorofosfato • Sono particolarmente utili per lo studio dei meccanismi delle reazioni enzimatiche Es. reagenti dei gruppi sulfidrilici: iodoacetamide, agente alchilante O Enz CH2SH + ICH2 C NH2 iodoacetamide O Enz CH2S CH2 C NH2 + HI Regolazione mediante COMPARTIMENTAZIONE - È utile per tenere separati i substrati o i prodotti di reazioni tra loro in competizione Meccanismi responsabili di un aumento degli enzimi nel plasma 1)necrosi o danno cellulare indotto da fattori tossici o da ischemia, in cui gli enzimi normalmente contenuti nel citoplasma fuoriescono dalle cellule per citolisi 2)variazione della quantità di tessuto: aumentato turnover cellulare che si realizza normalmente durante l'accrescimento, la rigenerazione cellulare o anche in corso di neoplasie 3)alterata sintesi: induzione enzimatica in cui aumenta la sintesi proteica dell'enzima 4)ostruzione dei dotti escretori per cui enzimi normalmente presenti nelle secrezioni esocrine si riversano nel plasma 5)variazione nella permeabilità cellulare 6)alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione 7)altri fattori che influenzano l’attività (inibitori, carenza di cofattori...) Inibitori come farmaci: i sulfamidici Inibitori enzimatici come agenti terapeutici Inibitore Enzima Applicazione AZT Trascrittasi inversa HIV Ritonavir, saquinavir Proteasi HIV HIV Sulfonammidi Diidrofolato sintasi Infezioni batteriche Trimetoprim, methotrexate Diidrofolato reduttasi Infezioni batteriche Allopurinolo Xantina ossidasi Gotta Statine HMG CoA reduttasi Sintesi colesterolo Cicloossigenasi Sintesi prostaglandine Aspirina Inibitori come farmaci: inibitori delle HIV proteasi • Il virus HIV utilizza aspartato proteasi per scindere poliproteine • Le proteasi tagliano legami particolari (Phe-Pro; Tyr-Pro) • occorrono inibitori ad alta specificità Le statine, agenti anti-iperlipidemici, sono farmaci che agiscono da inibitori COMPETITIVI Dosaggi enzimatici in Biochimica Clinica • Enzimi plasmatici a scopo diagnostico • carenze/difetti enzimatici responsabili di alterazioni metaboliche e patologie correlate Dosaggi enzimatici • Valutazioni cinetiche • Valutazioni cliniche • Dosaggio di metaboliti • Valutazioni merceologiche (alimentari) Gli enzimi nella diagnosi clinica N.B. Il plasma è la parte fluida non cellulare del sangue. Il siero è la parte liquida ottenuta centrifugando il sangue dopo averlo lasciato coagulare. Localizzazione Enzimatica Gli enzimi si possono trovare: • Liberi nelle cellule di diversi tessuti ed organi • Confinati in particolari strutture all’interno delle cellule stesse • In un determinato tessuto od organo specifico. Quando le strutture cellulari vengono danneggiate gli enzimi cellulari si liberano e si riversano nel circolo sanguigno. In questo modo, un aumento della loro concentrazione nel campione può rappresentare un indice abbastanza preciso di un danno cellulare. Enzimi plasmatici da dosare: • enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione) • enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi digestivi) • enzimi del metabolismo cellulare – ubiquitari – organo (tessuto)-specifici
