AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA “REAZIONE A CATENA

AMPLIFICAZIONE IN
VITRO DEL DNA
“REAZIONE A CATENA
DELLA POLIMERASI
(PCR)”
PCR: reazione polimerasica a
catena
• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio
Nobel 1993)
• Serve per ottenere una grande quantita’ di una
specifica sequenza di DNA in vitro
• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1
milione di volte
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A
DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI
OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA
REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE
DA AMPLIFICARE
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE
DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI
IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO
DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO
VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO
2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO
CON IL DNA STAMPO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL
FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus)
POLIMERASI
PCR: Reazione a catena della polimerasi
Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi
termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un
eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: Reazione a catena della polimerasi
PCR: amplificazione
n.ro cicli
n.ro sequenze bersaglio
1
0
3
2
10
256
15
8192
20
262.144
25
8.388.608
30
268.435.456
La sequenza bersaglio è la
sequenza di DNA sintetizzata
tra i due primers
Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter
essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10-12g) allora ~1 g of DNA
potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.
In 1  g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.
Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8  g in 25 cicli e 27  g in
30 cicli.
PCR
VANTAGGI:
• Sensibilita’
• Rapidita’
• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high
throughput)
• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso
campione
• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani,
o fissato
• SVANTAGGI:
• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)
• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza
• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e
messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)
• Può sintetizzare frammenti relativamente corti
• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq
pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)
Esempi di utilizzo della PCR
• Su DNA:
– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche
(mutazioni, inserzioni virali, micro-organismo patogeni) > PCR DIAGNOSTICA
– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come
sonde oppure da “clonare”
• Su RNA messaggero (RT-PCR):
– segnalare la presenza di specifiche molecole di
RNA (espressione genica, presenza di RNA di
micro-organismi infettivi)
– Amplificare frammenti specifici da usare in
seguito come sonde oppure da “clonare” isolare cDNA specifici per determinati geni.
PCR in genetica forense
Quale delle persone sospette può avere
commesso il crimine?
La tecnica PCR è utile, spesso
necessaria, per amplificare il DNA
estratto dai reperti trovati sulla scena del
delitto. Si usano sonde multi-locus con
molti alleli.
Diagnosi genetica pre-impianto
PCR utilizzata per rivelare uno
specifico mRNA:
PCR in seguito a trascrittasi inversa
(RT-PCR)
• Estrazione dell’RNA
• Purificazione dell’RNA poliadenilato (mRNA)
• Sintesi del cDNA con la trascrittasi inversa
3’
5’
cDNA
mRNA
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
PCR utilizzata per rivelare uno specifico mRNA:
PCR in seguito a trascrittasi inversa (RT-PCR)
cDNA
3’
5’
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
mRNA
• Amplificazione della sequenza di interesse con oligonuceotidi di
innesco specifici
5’
3’
5’
3’
3’
5’
• Analisi dei prodotti dell’amplificazione (elettroforesi)
TTTTTTTT 5’
AAAAAAAA 3’
Number of molecules
La PCR non e’ una tecnica
quantitativa
Number of cycles
PCR quantitativa: RT-PCR in
tempo reale
• Utilizza particolari sostanze la cui fluorescenza si
rivela quando intercalano la catena di DNA
sintetizzata durante la reazione di amplificazione.
• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la
misurazione della fluorescenza accumulata in
tempo reale, proporzionale al numero di molecole
amplificate e quindi al numero di molecole
presenti in partenza
Polymerase Chain Reaction: resa
Log[DNA]
• Resa teorica: 2n
P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente
con il numero di cicli di PCR (n)
Il prodotto di PCR dipende da T,numero di
copie di template di partenza
Plateau
Lineare
Esponenziale
Prodotto
variabile
N° cicli
termici
Polymerase Chain Reaction: plateau
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti
Soluzioni
• Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale
I l p ro d o t t o d i P C R è p ro p o r zio n a le a l t emp la t e in iz ia l e
• Questo è reso possibile mediante il rilevamento, di una fluorescenza, che è
p r o p o r z i o n a l e
a l
p r o d o t t o
d i
P C R
• La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata
utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti
il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR
RT-PCR convenzionale
Reverse
transcription
Real-time RT-PCR
Reverse
transcription
PCR
reaction
Nested
PCR reaction
Gel
electrophoresis
DNA
sequencing
Southern
blot
Manual or
automated
analysis
PCR reaction
Quantitative
result
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale
durante la fase esponenziale della PCR,
quando cioè l'efficienza di amplificazione è
influenzata minimamente dalle variabili di
reazione, permettendo di ottenere risultati
molto più accurati rispetto alla PCR
tradizionale "end point"
RT-PCR quantitativa
•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione
•Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio
•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computer
Plot lineare
Incremento di
fluorescenza
Cicli di PCR
Analisi tramite software
Chimiche fluorescenti
per PCR Real-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
sia sull'ibridazione di sonde specifiche.
SYBR Green
SYBR Green: principio
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
SYBR Green
All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di
reazione contiene DNA denaturato, primers e la
molecola fluorescente
SYBR Green
Dopo l’annealing dei primers, si legano
poche molecole fluorescenti alla doppia elica.
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’ aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche,
includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di
prodotti aspecifici
TaqMan
TaqMan
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
 coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano
in
maniera
aspecifica
a
tutto
il
DNA
 sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse,
m a r c a t e c o n m o l e c o l e f l u o r e s c e n t i
Esistono diversi tipi di sonde:
Dual-labeled (come le sonde TaqMan)
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere complementare
alla sequenza bersaglio da amplificare
3’
5’
5’
Primer
R
3’
5’
Q
3’
5’
Primer
3’
5’
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
3’
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed
all’estremità 3’ una molecola “Quencher”
5’
3’
Reporter-Quencher
Dye
Quencher
5,6 FAM
BHQ-1/TAMRA
HEX/JOE
BHQ-2
Texas Red/ROX BHQ-2
Cy5/Quasar670
BHQ-2 ( or-3)
6-carbossifluoresceina
6-carbossitetrametilrodamina
Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè
i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Real-Time PCR:
attività 5’>3’ esonucleasica
3’
5’
3’
R
Q
5’
R
3’
Q
5’
5’
R
3’
5’
Q
5’
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
Real-Time PCR: applicazioni
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•
•
•
•
Quantificazione virale
Quantificazione dell’espressione genica
Efficacia della terapia farmacologica
Misura dei danni al DNA
Controllo di qualità e validazione dei saggi
Detenzione dei patogeni
Controllo degli OGM
Genotyping