Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA

PCR - Polymerase Chain Reaction
ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il
premio Nobel per la chimica (1993).
Questa tecnica, utilizzando i principi della
duplicazione del DNA,
permette di ottenere in poco tempo
notevoli quantità di materiale specifico
Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91.
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,
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT,
Mullis KB, Erlich HA.
Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA
94608.
A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA
amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme,
isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and,
by enabling the amplification reaction to be performed at higher
temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity,
and length of products that can be amplified. Single-copy genomic
sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very
high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily
amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a
target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells.
PCR schema
•
•
•
•
•
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Nucleotidi trifosfati
Ioni Mg++
Campione
DNA bersaglio
Primers
Enzima
Oligonucleotidi sintetici complementari
a sequenze fiancheggianti il tratto di
DNA da studiare 20 – 25 bp
DNA polimerasi
Nucleotidi trifosfati
Termociclatori
Denaturazione del DNA
(94°C)
Ibridazione dei primers al bersaglio
(40°C – 60°C)
Sintesi del DNA
(72°C)
VIDEO
End Point PCR
Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della
reazione un’aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per
verificare:
1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in bp
mediante ladder);
2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all’intensità della
banda);
3. L’assenza di frammenti aspecifici.
Vantaggi
• Si può evitare l’uso di tecniche più
laboriose. Velocità di esecuzione
• Si possono analizzare campioni di
poche cellule (anche 1 cellula). Elevata
sensibilità
Applicazioni
Biopsie
Analisi prenatale e Analisi preimpianto
Tracce di infezioni virali
Malattia mimima residua
Medicina forense
La PCR end-point non è un metodo quantitativo
Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è
proporzionale all’intensità della banda ottenuta.
Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo.
•Ricerca di mutazioni note;
•Ricerca di mutazioni non ancora identificate.
Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR
Disease
Affected Gene
Severe-combined immunodeficiency,
SCID
adenosine deaminase (ADA)
Lesch-Nyhan syndrome
hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase
(HGPRT)
α1-Antitrypsin deficiency
α1-Antitrypsin
Cystic fibrosis
cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR)
protein
Fabry disease
α-galactosidase
Gaucher disease
acid β-glucosidase (glucocerebrosidase)
Sandhoff disease
hexosaminidase A and B
Tay-Sachs disease
hexosaminidase A
Familial hypercholesterolemia (FH)
LDL receptor
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
deficiency
glucose-6-phosphate dehydrogenase
Maple syrup urine disease
branched-chain α-keto acid dehydrogenase
Phenylketonuria (PKU)
phenylalanine hydroxylase
Ornithine transcarbamylase deficiency
ornithine transcarbamylase
Retinoblastoma (Rb)
RB gene product, pRB
Sickle-cell anemia
point mutation in β-globin
β-Thalassemia
mutations in β-globin gene that result in loss of
synthesis of protein
Hemophilia A
Factor VIII
Hemophilia B
Factor IX
Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras
nella biopsia del paziente
Codon
12
13
Mutation;
Aminoacid
change
Nucleotide substitution
GGT
TGT; G12C
G
T
GGT
GTT; G12V
G
T
GGT
GAT; G12D
G
A
GGT
GCT; G12A
G
C
GGT
AGT; G12S
G
A
GGT
CGT; G12R
G
C
GGC
GAC; G13D
G
A
Disegno dei Primers
Digestione con enzimi di restrizione di DNA
amplificato con PCR;
controllo della grandezza dei frammenti su gel
M
1
2
3
4
187 bp
165 bp
+-
+-
++
++
Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G)
In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l’enzima DdeI (CTNAG),
perciò l'enzima taglia il DNA con la mutazione
Frammento non tagliato 187 bp (no mutazione)
Frammento più piccolo 165 bp (presenza di mutazione)
(+ presenza della mutazione; - mutazione assente;
M = marcatore di peso molecolare)
Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII
Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad
oligonucleotidi
allele
specifici
(ASO)
ARMS
“Amplification refractory mutation system”
(amplificazione allele specifica)
• Si
eseguono
due
amplificazioni
parallele.
• Uno dei primer è comune ad entrambe
le reazioni;
• l’altro in una reazione è specifico per
l’allele normale, nell’altra per l’allele
mutato
PCR allele specifica
Multiplex ARMS test per individuare 4
specifiche mutazioni che causano la fibrosi
cistica
PCR con primers localizzati agli estremi di una
delezione o di un breakpoint di traslocazione
RT-PCR
Reverse transcription-PCR
Log[DNA]
Plateau
Lineare
Prodotto
variabile
Esponenzial
e
N° cicli
termici
Polymerase Chain Reaction: plateau
Resa effettiva: effetto plateau
Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”,
esso è limitato da:
Quantità dei primers
Attività della Taq polimerasi
Reannealing dei filamenti
Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei
prodotti
Perché Real-Time?
Misura l'amplificazione in tempo reale
durante la fase esponenziale della
PCR, quando cioè l'efficienza di
amplificazione è influenzata
minimamente dalle variabili di
reazione, permettendo di ottenere
risultati molto più accurati rispetto alla
PCR tradizionale "end point"
Real Time PCR
Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza
emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo.
La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata
utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori
fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di
PCR
Chimiche fluorescenti
per PCR RealReal-Time
•La fluorescenza si genera durante la PCR per
effetto di diverse possibili reazioni chimiche
•Le chimiche principali sono basate sia sul
legame di coloranti fluorescenti che si intercalano
nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,
s i a s ul l ' i br i d a z i o n e di s o n de s p e c i f i c h e .
SYBR Green:SYBR
principio
Green I
Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si
lega al solco minore del DNA
SYBR Green
Durante l’elongazione si verifica un aumento di
fluorescenza che corrisponde all’ aumento del
numero di copie dell’amplicone
SYBR green
• Metodica semplice
Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa
• Non costosa
• Non-specifica
– La molecola fluorescente si lega random a tutte le
doppie eliche, includendo i dimeri di primers
– È necessario ottimizzare la metodica per evitare la
formazione di prodotti aspecifici
Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati
e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione
Curva di dissociazione
Tm
melting peak
82.6
88.1
TaqMan
La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego:
 coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano
in
maniera
aspecifica
a
tutto
il
DNA
 sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di
interesse, marcate con molecole fluorescenti
Esistono diversi tipi di sonde:
Dual-labeled (come le sonde TaqMan)
Molecular beacons
Scorpion
Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Sonde TaqMan
La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i
primers della PCR, viene disegnato per essere
complementare alla sequenza bersaglio da amplificare
R
5’
3’
5’
Primer
3’
5’
Q
3’
5’
3’
Primer
5’
La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno
del frammento amplificato nella reazione di PCR
3’
Sonda TaqMan
Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter”
ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher”
5’
3’
Reporter-Quencher
5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette
fluorescenza
3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che
spegne la fluorescenza del reporter
R
Q
5’
3’
Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R
perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q
Real Time PCR
L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente
proporzionale al numero di ampliconi generati
Forward primer
Probe
Reverse primer
Curve di amplificazione
Fluorescenza
Plot lineare
Cicli di amplificazione
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il
cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla
quantità di template iniziale
Quantificazione
ASSOLUTA
i campioni sono quantificati in modo assoluto
Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione
assoluta (utilizzo di una standard curve)
Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche
quantità di campioni
RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT
Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una
standard curve)
Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro
CT con quello del controllo endogeno
Quantitativa relativa: analisi dei dati
 Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)
espresso costitutivamente (CT)
 Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un
trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb)
(CT)
2- (CT,r- CT,cb)= 2- CT
 Il valore così ottenuto permette di determinare la
concentrazione relativa del target
Valutare le differenze di espressione
2-
CT
2- CT > 3
up regolati
2- CT
< 0.3
down regolati
ln 2ln 2- CT < 1
down regolati
CT
ln 2- CT > 1
up regolati
Esempio di quantificazione relativa usando il metodo
2Old
BRAF
NOD1
CARD6
CARD8
CASP1
CASP10
CASP14
CASP2
CASP3
CASP4
CASP5
CASP6
CASP7
CASP8
CASP9
CD40
CD40LG
CFLAR
CIDEA
CIDEB
CRADD
DAPK1
CT
Young
Ct (dRn)
Ct HPRT
DELTA Ct
old
Ct
28,1
26,77
29,19
30,67
26,54
29,14
31,06
27,51
27,99
25,84
29,47
25,95
28,3
34,12
25,28
33,28
28,09
25,15
30,9
30,76
27,43
31,31
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
19,23
8,87
7,54
9,96
11,44
7,31
9,91
11,83
8,28
8,76
6,61
10,24
6,72
9,07
14,89
6,05
14,05
8,86
5,92
11,67
11,53
8,2
12,08
27,18
25,78
29,69
29,12
25,82
28,01
29,6
26,11
26,9
24,39
28,85
24,29
26,86
29
24,32
29,3
30
24,13
29,56
29,35
26,09
29,58
Ct HPRT delta Ct young
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
17,63
9,55
8,15
12,06
11,49
8,19
10,38
11,97
8,48
9,27
6,76
11,22
6,66
9,23
11,37
6,69
11,67
12,37
6,5
11,93
11,72
8,46
11,95
Delta
Delta Ct
0,68
0,61
2,1
0,05
0,88
0,47
0,14
0,2
0,51
0,15
0,98
-0,06
0,16
-3,52
0,64
-2,38
3,51
0,58
0,26
0,19
0,26
-0,13
potenza
ln
0,624165 -0,47134
0,655197 -0,42282
0,233258 -1,45561
0,965936 -0,03466
0,543367 -0,60997
0,721965 -0,32578
0,907519 -0,09704
0,870551 -0,13863
0,702222 -0,35351
0,90125 -0,10397
0,50698 -0,67928
1,042466 0,041589
0,895025
-0,1109
11,47164 2,439878
0,641713 -0,44361
5,205367 1,64969
0,087778 -2,43295
0,668964 -0,40203
0,835088 -0,18022
0,876606
-0,1317
0,835088 -0,18022
1,094294 0,090109
Real-Time PCR: applicazioni
• Quantificazione virale
• Quantificazione dell’espressione
genica
• Efficacia della terapia farmacologica
• Detenzione dei patogeni
• Controllo degli OGM
• Genotyping
• MRD