PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA, permette di ottenere in poco tempo notevoli quantità di materiale specifico Science. 1988 Jan 29;239(4839):487-91. Related Articles Links , Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. Cetus Corporation, Department of Human Genetics, Emeryville, CA 94608. A thermostable DNA polymerase was used in an in vitro DNA amplification procedure, the polymerase chain reaction. The enzyme, isolated from Thermus aquaticus, greatly simplifies the procedure and, by enabling the amplification reaction to be performed at higher temperatures, significantly improves the specificity, yield, sensitivity, and length of products that can be amplified. Single-copy genomic sequences were amplified by a factor of more than 10 million with very high specificity, and DNA segments up to 2000 base pairs were readily amplified. In addition, the method was used to amplify and detect a target DNA molecule present only once in a sample of 10(5) cells. PCR schema • • • • • DNA bersaglio Primers Enzima Nucleotidi trifosfati Ioni Mg++ Campione DNA bersaglio Primers Enzima Oligonucleotidi sintetici complementari a sequenze fiancheggianti il tratto di DNA da studiare 20 – 25 bp DNA polimerasi Nucleotidi trifosfati Termociclatori Denaturazione del DNA (94°C) Ibridazione dei primers al bersaglio (40°C – 60°C) Sintesi del DNA (72°C) VIDEO End Point PCR Il campione si sottopone al numero di cicli stabiliti (30-40), alla fine della reazione un’aliquota si sottopone ad elettroforesi su gel di agorosio per verificare: 1. la lunghezza dell’amplificato (controllo del peso molecolare in bp mediante ladder); 2. La quantità di amplificato ottenuto (proporzionale all’intensità della banda); 3. L’assenza di frammenti aspecifici. Vantaggi • Si può evitare l’uso di tecniche più laboriose. Velocità di esecuzione • Si possono analizzare campioni di poche cellule (anche 1 cellula). Elevata sensibilità Applicazioni Biopsie Analisi prenatale e Analisi preimpianto Tracce di infezioni virali Malattia mimima residua Medicina forense La PCR end-point non è un metodo quantitativo Alla fine della reazione non sempre la quantità di DNA del campione d’origine è proporzionale all’intensità della banda ottenuta. Utilizzando particolari accorgimenti può diventare un metodo semi-quantitativo. •Ricerca di mutazioni note; •Ricerca di mutazioni non ancora identificate. Examples of Inherited Disorders Detectable by PCR Disease Affected Gene Severe-combined immunodeficiency, SCID adenosine deaminase (ADA) Lesch-Nyhan syndrome hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) α1-Antitrypsin deficiency α1-Antitrypsin Cystic fibrosis cystic fibrosis transmembrane conductance (CFTR) protein Fabry disease α-galactosidase Gaucher disease acid β-glucosidase (glucocerebrosidase) Sandhoff disease hexosaminidase A and B Tay-Sachs disease hexosaminidase A Familial hypercholesterolemia (FH) LDL receptor Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency glucose-6-phosphate dehydrogenase Maple syrup urine disease branched-chain α-keto acid dehydrogenase Phenylketonuria (PKU) phenylalanine hydroxylase Ornithine transcarbamylase deficiency ornithine transcarbamylase Retinoblastoma (Rb) RB gene product, pRB Sickle-cell anemia point mutation in β-globin β-Thalassemia mutations in β-globin gene that result in loss of synthesis of protein Hemophilia A Factor VIII Hemophilia B Factor IX Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras nella biopsia del paziente Codon 12 13 Mutation; Aminoacid change Nucleotide substitution GGT TGT; G12C G T GGT GTT; G12V G T GGT GAT; G12D G A GGT GCT; G12A G C GGT AGT; G12S G A GGT CGT; G12R G C GGC GAC; G13D G A Disegno dei Primers Digestione con enzimi di restrizione di DNA amplificato con PCR; controllo della grandezza dei frammenti su gel M 1 2 3 4 187 bp 165 bp +- +- ++ ++ Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041 C>G) In questo caso la mutazione crea un sito di restrizione per l’enzima DdeI (CTNAG), perciò l'enzima taglia il DNA con la mutazione Frammento non tagliato 187 bp (no mutazione) Frammento più piccolo 165 bp (presenza di mutazione) (+ presenza della mutazione; - mutazione assente; M = marcatore di peso molecolare) Scomparsa di un sito BclI nel gene del fattore VIII Ibridazione di DNA amplificato con PCR ad oligonucleotidi allele specifici (ASO) ARMS “Amplification refractory mutation system” (amplificazione allele specifica) • Si eseguono due amplificazioni parallele. • Uno dei primer è comune ad entrambe le reazioni; • l’altro in una reazione è specifico per l’allele normale, nell’altra per l’allele mutato PCR allele specifica Multiplex ARMS test per individuare 4 specifiche mutazioni che causano la fibrosi cistica PCR con primers localizzati agli estremi di una delezione o di un breakpoint di traslocazione RT-PCR Reverse transcription-PCR Log[DNA] Plateau Lineare Prodotto variabile Esponenzial e N° cicli termici Polymerase Chain Reaction: plateau Resa effettiva: effetto plateau Il processo di duplicazione non procede “all’infinito”, esso è limitato da: Quantità dei primers Attività della Taq polimerasi Reannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento nei prodotti Perché Real-Time? Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point" Real Time PCR Si utilizzano particolari termociclatori in grado misurare la fluorescenza emessa da particolari fuorofori ad ogni ciclo. La fluorescenza, durante ogni ciclo di amplificazione, può essere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo ma anche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue la stessa cinetica della reazione di PCR Chimiche fluorescenti per PCR RealReal-Time •La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche •Le chimiche principali sono basate sia sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green, s i a s ul l ' i br i d a z i o n e di s o n de s p e c i f i c h e . SYBR Green:SYBR principio Green I Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA SYBR Green Durante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone SYBR green • Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa • Non costosa • Non-specifica – La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers – È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici Curva di dissociazione Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene monitorata per generare una curva di dissociazione Curva di dissociazione Tm melting peak 82.6 88.1 TaqMan La Real-Time PCR si può realizzare mediante l’impiego: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si legano in maniera aspecifica a tutto il DNA sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento di interesse, marcate con molecole fluorescenti Esistono diversi tipi di sonde: Dual-labeled (come le sonde TaqMan) Molecular beacons Scorpion Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Sonde TaqMan La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare R 5’ 3’ 5’ Primer 3’ 5’ Q 3’ 5’ 3’ Primer 5’ La sonda è disegnata in modo da ibridarsi all’interno del frammento amplificato nella reazione di PCR 3’ Sonda TaqMan Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” ed all’estremità 3’ una molecola “Quencher” 5’ 3’ Reporter-Quencher 5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza 3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia che spegne la fluorescenza del reporter R Q 5’ 3’ Se R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto di R perchè i fotoni di R vengono assorbiti da Q Real Time PCR L’aumento di fluorescenza del Reporter è direttamente proporzionale al numero di ampliconi generati Forward primer Probe Reverse primer Curve di amplificazione Fluorescenza Plot lineare Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale Quantificazione ASSOLUTA i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una standard curve) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA la quantificazione viene effettuata paragonando i CT Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una standard curve) Gli unknowns vengono “quantificati” paragonando il loro CT con quello del controllo endogeno Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (CT) Comparare ciascun CT così ottenuto con il CT di un trattamento di controllo anche detto “calibratore” (cb) (CT) 2- (CT,r- CT,cb)= 2- CT Il valore così ottenuto permette di determinare la concentrazione relativa del target Valutare le differenze di espressione 2- CT 2- CT > 3 up regolati 2- CT < 0.3 down regolati ln 2ln 2- CT < 1 down regolati CT ln 2- CT > 1 up regolati Esempio di quantificazione relativa usando il metodo 2Old BRAF NOD1 CARD6 CARD8 CASP1 CASP10 CASP14 CASP2 CASP3 CASP4 CASP5 CASP6 CASP7 CASP8 CASP9 CD40 CD40LG CFLAR CIDEA CIDEB CRADD DAPK1 CT Young Ct (dRn) Ct HPRT DELTA Ct old Ct 28,1 26,77 29,19 30,67 26,54 29,14 31,06 27,51 27,99 25,84 29,47 25,95 28,3 34,12 25,28 33,28 28,09 25,15 30,9 30,76 27,43 31,31 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 19,23 8,87 7,54 9,96 11,44 7,31 9,91 11,83 8,28 8,76 6,61 10,24 6,72 9,07 14,89 6,05 14,05 8,86 5,92 11,67 11,53 8,2 12,08 27,18 25,78 29,69 29,12 25,82 28,01 29,6 26,11 26,9 24,39 28,85 24,29 26,86 29 24,32 29,3 30 24,13 29,56 29,35 26,09 29,58 Ct HPRT delta Ct young 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 17,63 9,55 8,15 12,06 11,49 8,19 10,38 11,97 8,48 9,27 6,76 11,22 6,66 9,23 11,37 6,69 11,67 12,37 6,5 11,93 11,72 8,46 11,95 Delta Delta Ct 0,68 0,61 2,1 0,05 0,88 0,47 0,14 0,2 0,51 0,15 0,98 -0,06 0,16 -3,52 0,64 -2,38 3,51 0,58 0,26 0,19 0,26 -0,13 potenza ln 0,624165 -0,47134 0,655197 -0,42282 0,233258 -1,45561 0,965936 -0,03466 0,543367 -0,60997 0,721965 -0,32578 0,907519 -0,09704 0,870551 -0,13863 0,702222 -0,35351 0,90125 -0,10397 0,50698 -0,67928 1,042466 0,041589 0,895025 -0,1109 11,47164 2,439878 0,641713 -0,44361 5,205367 1,64969 0,087778 -2,43295 0,668964 -0,40203 0,835088 -0,18022 0,876606 -0,1317 0,835088 -0,18022 1,094294 0,090109 Real-Time PCR: applicazioni • Quantificazione virale • Quantificazione dell’espressione genica • Efficacia della terapia farmacologica • Detenzione dei patogeni • Controllo degli OGM • Genotyping • MRD