INFORMAZIONI SU ALCUNE CONDIZIONI GENETICHE
FIBROSI CISTICA (CFTR)
La fibrosi cistica è una malattia genetica a trasmissione autosomico-recessiva causata da
mutazioni del gene CFTR; nella popolazione i portatori di mutazioni a carico di un solo allele
(eterozigoti) sono circa 1/25.
Il test molecolare permette l’individuazione delle mutazioni più frequenti associate alla
malattia. Inoltre la variazione del copy number di uno o più esoni del gene CFTR può
rappresentare sino al 10% delle mutazioni nella maggior parte delle popolazioni studiate.
La metodica impiegata prevede PCR ed ibridazione inversa.
SINDROME X FRAGILE (FMR-1)
La Sindrome X fragile (anche detta Sindrome di Martin-Bell; ritardo mentale X-linked)
costituisce la più frequente causa genetica di ritardo mentale nel maschio.
Il test è indicato per:
• individui con ritardo mentale, autismo
• storia familiare di ritardo mentale
• coppie con rischio riproduttivo per ritardo mentale
• diagnosi prenatale in feto da madre portatrice
• tremori/ atassia maschile (FXTAS)
• menopausa precoce (POF)
Il test molecolare individua espansioni CGG al 5’ del gene FMR-1.
La metodica impiegata prevede PCR ed elettroforesi capillare ed analisi Southern blot con
sonda StB12.3
ALZHEIMER (apoE)
ApoE è una apolipoproteina implicata nel metabolismo lipidico; nella popolazione umana è
presente in tre isoforme, denominate e2-e3-e4, che deteminano sei possibili fenotipi.
La presenza della forma allelica apoE-e4 è stata associata all’insorgenza del morbo di
Alzheimer in età avanzata, sia sporadico che familiare.
Sebbene esistano pareri non favorevoli all’utilizzo del genotyping di apoE come test
predittivo, tale genotyping può risultare molto utile nella diagnosi differenziale di Alzheimer
in pazienti con accertati segni clinici di demenza.
Il test molecolare individua i 6 possibili genotipi di apoE.
La metodica impiegata prevede PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel agarosio
Nusieve.
ALZHEIMER (PS1)
PS1 (presenilina 1) è una proteina componente i complessi proteici ad alto peso molecolare
nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato del Golgi.
Il gene codificante tale proteina è localizzato sul cromosoma 14; sono state descritte oltre 50
diverse mutazioni di questo gene in pazienti con forme familiari ad esordio precoce. Queste
mutazioni rapppresentano la causa più comune di origine genetica della malattia di Alzheimer
familiare ad esordio precoce (28-60 anni).
Il test molecolare viene eseguito mediante sequenziamento diretto dell’esone 5 del gene
PS1.
STERILITÀ/ANOMALIE
DELLA
DIFFERENZIAZIONE
SESSUALE (SRYsex
determining regionY)
La ricerca di SRY viene fatta in pazienti con Sindrome di Turner (Monosomia X). La Sindrome
di Turner ha una frequenza alla nascita di circa 1/2500. La monosomia omogenea dell’X,
(45,X) è presente in molte delle pazienti, mentre in altri casi si riscontrano anomalie
strutturali del cromosoma X o mosaicismo cromosomico (non sempre rilevabile
citogeneticamente).
Poiché in una delle linee cellulari potrebbe essere presente il cromosoma Y, o parti di esso, è
opportuno escludere questa eventualità attraverso un test di amplificazione genica di
sequenze Y-specifiche. In particolare viene ricercata la sequenza SRY (sex-determining
region on Y chromosome), principalmente coinvolta nella differenziazione gonadica maschile.
Il test molecolare viene eseguito mediante PCR, ed elettroforesi su gel di agarosio.
E’ disponibile anche il sequenziamento del gene per la ricerca di eventuali mutazioni.
ACONDROPLASIA/IPOCODROPLASIA (FGFR3)
Costituiscono le più comuni forme ereditarie di malattie che causano bassa statura, dovute
ad una delle due possibili mutazioni a carico del gene per il Recettore 3 del Fattore di
crescita per i Fibroblasti (FGFR3). Più del 90% dei casi sono sporadici, talora associati ad una
avanzata età paterna.
Il test viene raccomandato per:
• confermare la diagnosi in soggetti con fenotipo caratteristico
• diagnosi prenatale di acondroplasia
Il test molecolare per la acondroplasia individua le mutazioni c.1138G>A, p.Gly380Arg e
c.1138G>C, p.Gly380Arg nel gene FGFR3.
Il test molecolare per la ipocondroplasia individua le mutazioni c.1620C>A, p.Asn540Lys
(frequenza 49%), c.1620C>G, p.Asn540Lys (frequenza 21%) e c.1612A>G, p.Ile538Val
(frequenza <2%) nel gene FGFR3.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 8 e 11 del gene FGFR3.
SINDROMI DA MICRODELEZIONI/RITARDO MENTALE
Il 5% (Knight, 1997), il 6% (Biesecker, 2002), il 2.5% (Ravnan, 2006) dei ritardi mentali
idiopatici (da moderati a severi) presenta riarrangiamenti a livello delle regioni
subtelomeriche e pertanto, in assenza di un quadro clinico che indirizzi verso una sindrome
specifica, viene valutata la integrità di tutte le estremità telomeriche.
A tutt’oggi solo alcuni sbilanciamenti telomerici hanno mostrato di avere un fenotipo distinto
e riconoscibile: del 1p, 4p, 5p, 9q, 17p e 22q.
Riarrangiamenti criptici di alcune regioni cromosomiche sono responsabili di sindromi che
causano ritardo mentale (S. Williams, S. Prader Willi, S. Angelman, S. Miller Dieker, S. Smith
Magenis, S. Alagille, Di George/VCF, S. Sotos, S. Saethre-Chotzen)
E’ possibile individuare tali sindromi da delezioni e duplicazioni cromosomiche e valutare la
integrità delle estremità telomeriche utilizzando una tecnica di recente introduzione
denominata MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) che permette anche di
determinare lo stato di metilazione di specifiche regioni cromosomiche (CpG island).
L'analisi dello stato di metilazione di specifiche regioni del cromosoma 15 consente di
individuare la quasi totalità dei casi di Sindrome di PraderWilli/Angelman.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA.
SINDROME DI BECKWITH-WIEDEMANN
La sindrome di Beckwith-Wiedemann è una patologia poligenica causata da disregolazione
dell'espressione dei geni presenti nella regione cromosomica 11p15, che è una regione
soggetta a imprinting. Sono stati implicati vari difetti della regione cromosomica 11p15
(alterato numero di copie, disopia uniparentale, mutazioni geniche) e i difetti epigenetici
sono responsabili di circa due terzi dei casi. L'incidenza stimata è di 1/13.700 nati vivi.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare sia difetti
nel numero di copie che lo stato di metilazione della regione cromosomica 11p15.
SINDROME DI SILVER-RUSSELL
La sindrome di Silver-Russell è una patologia geneticamente eterogenea. Circa il 30% dei
casi mostra ipometilazione del gene H19, localizzato sulla regione 11p15 soggetta a
imprinting. L'ipometilazione è dovuta in molti casi a un meccanismo epigenetico o a un
microriarrangiamento genomico, come la microduplicazione materna L'incidenza è stimata in
1-30/100.000 casi.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare sia difetti
nel numero di copie che lo stato di metilazione della regione cromosomica 11p15.
MALATTIA DI CHARCOT-MARIE TOOTH/NEUROPATIA EREDITARIA CON
IPERSENSIBILITÀ ALLA PRESSIONE (HNPP)
La malattia di Charcot-Marie-Tooth è una neuropatia periferica ereditaria, la cui prevalenza è
stimata 1/2500. Sono note tre forme: demielinizzante (CMT1), dominante legata all'X
(CMTX1) e neuronale (CMT2). La forma CMT1 è caratterizzata da duplicazione di una regione
di 1.5Mb sul cromosoma 17p11.2. La delezione della medesima regione è responsabile
dell'80% dei casi di neuropatia ereditaria con ipersensibilità alla pressione (HNPP).
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare i difetti
nel numero di copie della regione cromosomica 17p11.2.
ATROFIE MUSCOLARI SPINALI
Le atrofie muscolari spinali (SMA) sono un gruppo di malattie neuromuscolari: ne vengono
definiti quattro tipi in base all'età d'esordio e alla gravità della malattia. Il 95% circa delle
SMA è causato da delezioni omozigoti del solo esone 7 o degli esoni 7 e 8 del gene SMN1
(cromosoma 5q12.2-q13.3) che codifica per la proteina SMN. È stato inoltre identificato un
secondo gene (cromosoma 5q12.2-q13.3) che contribuisce a produrre solo il 10% della
proteina SMN a lunghezza completa. Pur con alcune eccezioni, la gravità della SMA correla
inversamente con il numero delle copie del gene SMN2. L'incidenza è stimata in circa
1/30.000.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA che permette di indagare difetti nel
numero di copie dei geni SMN1 ed SMN2.
SINDROMI MED12-CORRELATE: SINDROME DI OPITZ-KAVEGGIA (FG tipo 1) E
SINDROME DI LUJAN-FRYNS
Mutazioni del gene MED12 (cromosoma Xq13), che codifica per una delle proteine del
complesso di inizio della trascrizione, sono responsabili di due differenti malattie genetiche
con trasmissione X-linked recessiva: la sindrome di Opitz-Kaveggia (FG tipo 1) e la sindrome
di Lujan-Fryns.
Le mutazioni p.G958E e p.R961W nell'esone 21 del gene MED12 causano la sindrome di
Opitz-Kaveggia, caratterizzata da deficit cognitivo, ipotonia, macrocefalia, dismorfismi facciali
e malformazioni multiple.
La mutazione p.N1007S nell'esone 22 del gene MED12 causa la sindrome di Lujan Fryns,
caratterizzata da deficit cognitivo, macrocefalia, dismorfismi facciali, habitus marfanoide
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 21, 22 del gene MED12.
TEST DI VALUTAZIONE DELLA PREDISPOSIZIONE GENETICA ALLO SVILUPPO DI
PATOLOGIE TROMBOEMBOLICHE
Circa il 30% dei pazienti affetti da trombosi hanno familiari affetti dalla medesima patologia.
Alcuni difetti ereditari contribuiscono ad uno stato di trombofilia: fattore V Leiden, mutazione
G20120A del gene della protrombina, mutazione C677T del gene MTHFR, associato ad
iperomocisteinemia. La presenza di tali mutazioni incrementa il rischio di malattia
tromboembolica.
I test molecolari sono suggeriti per:
• donne in trattamento estroprogestinico anticoncezionale
donne in trattamento sostitutivo ormonale
individui con familiarità per episodi tromboembolici
pazienti con episodi tromboembolici in età giovanile
abortività ripetuta
I test vengono eseguiti in Real Time PCR.
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TEST DI VALUTAZIONE DELLA PREDISPOSIZIONE GENETICA ALLO SVILUPPO DEI
TUMORI
BRCA1 e BRCA2 (Tumore familiare mammella-ovaio)
Secondo il National Cancer Institute (NCI) 1 donna su 50 entro i 50 anni di età ed 1 donna
su 10 entro gli 80 anni si ammala di cancro alla mammella. Il rapporto maschi/femmine è di
1/125. Se pure molti fattori non genetici sono stati identificati, nel 5-10% dei casi si ritiene
che la causa più importante di cancro mammario sia la presenza di geni di suscettibilità. A
tutt’oggi sono stati identificati i geni maggiori BRCA1 e BRCA2, ereditati secondo modalità
autosomica dominante, le cui mutazioni determinano predisposizione allo sviluppo di tumori
mammella/ovaio. I figli di individui portatori di mutazioni BRCA 1 e 2 hanno la probabilità del
50% di ereditare la medesima mutazione. La strategia più efficace si è dimostrata l’analisi
genetica a partire da un individuo malato, seguita dalla identificazione della mutazione e
quindi dall’estensione dell’indagine ai familiari a rischio. La valutazione del rischio viene
eseguita secondo Gail (1989) e Claus (1994), mentre la predizione del rischio di mutazione
BRCA è valutata in accordo a Shattuck-Eidens (1997) e BRCAPRO (1997, 1998).
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni dei geni BRCA1 e BRCA2.
Si stima che dal 5 al 15% di casi di cancro alla mammela di origine familiare sia dovuto a
variazioni di “copy number” di uno o più esoni in BRCA1 e BRCA2 ed è stata descritta una
ampia varietà di delezioni e duplicazioni.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA.
PALB2 (Partner di localizzazione nucleare di BRCA2)
Il gene PALB2, localizzato sul braccio corto del cromosoma 16, codifica per una proteina
definita come partner di localizzazione nucleare di BRCA2. PALB2 svolge funzione
stabilizzante di BRCA2 in corrispondenza dei foci nucleari, consentendo in tal modo
l’attivazione del pathway di riparo del DNA: viene pertanto definito in letteratura come gene
a bassa suscettibilità per cancro alla mammella.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto dei
13 esoni del gene PALB2.
Le variazioni di “copy number” uno o più esoni in PALB2 vengono valutate mediante tecnica
MLPA.
p53
Mutazioni germinali in P53 causano la sindrome di Li-Fraumeni una rara malattia ereditaria
caratterizzata dallo sviluppo di neoplasie giovanili (prima dei 45 anni) e pediatriche a carico
di diversi organi e tessuti.
Tra le neoplasie tipiche di questa malattia in ordine di frequenza:
- carcinoma della mammella femminile (età media: 36 anni)
- sarcomi dell’osso e dei tessuti molli
- neoplasie cerebrali ad insorgenza nell’infanzia o in età giovane-adulta
- carcinoma della corteccia del surrene nell’infanzia o in età giovane-adulta
- carcinomi a carico di altri organi (tratto digerente e respiratorio), leucemie e linfomi.
Le mutazioni a carico di P53 sono molto rare e perciò rendono conto di una piccolissima
quota del rischio di tipo familiare.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni del gene p53.
CHEK2
La proteina checkpoint kinase 2 (CHEK2), prodotto del gene CHEK2 localizzzato sul
cromosoma 22q, rappresenta un elemento di segnale filogeneticamente conservato
all’interno della rete cellulare che risponde ai danni del DNA e partecipa al mantenimento
della integrità genomica.
La mutazione c.1100delC p.T367fsX15 nell’esone 10 del gene CHEK2 rappresenta un allele di
predisposizione al cancro della mammella a bassa penetranza.
La frequenza della mutazione c.1100delC è decisamente variabile in popolazioni differenti e
comunque tale variante è rara in tutte la popolazioni studiate.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA.
MLH1/MSH2/MSH6
Esistono due modelli distinti nella progressione del cancro gastrointestinale definiti da due
tipi di instabilità genomica: instabilità cromosomica (CIN) ed instabilità dei microsatelliti
(MSI) associata ad un “pathway mutante”; tale fenotipo si trova nel 15% di CCR sporadico
ed è caratterizzato da piccole inserzioni e delezioni in sequenze di microsatelliti che ne
causano alterazioni nella lunghezza; all’MSI pathway sono riconducibili anche tumori
(endometrio e meno frequentemente stomaco, vie urinarie, vie biliari, ovaio, piccolo
intestino, pancreas ed altri) associati a Sindrome di Lynch (HNPCC: Hereditary Non Poliposic
Colorectal Cancer) ed alcuni tumori gastrointestinali ed endometriali. Tale predisposizione
ereditaria allo sviluppo di cancro colpisce 1/200-1000 individui ed è caratterizzata da precoce
età di insorgenza.
Il fenotipo riconducibile all’MSI pathway è causato da mutazioni germinali nei geni del
MisMatch Repair (MMR) MSH2-MSH3-MSH6, MLH1-MLH3 e PMS1- PMS2; mutazioni germinali
in MLH1 ed MSH2 ne rappresentano la causa maggiore.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni dei geni MLH1/MSH2/MSH6.
Si stima che circa il 13% delle mutazioni germinali che interessano MLH1 ed MSH2 sono
rappresentate da delezioni intrageniche.
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA.
APC/Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP)
Il gene oncosoppressore APC, situato sul cromosoma 5q21-q22, è associato sia a sindromi
ereditarie ( FAP) che a neoplasie sporadiche colorettali. La forma classica di FAP è dovuta a
mutazioni germinali nel gene APC ed inoltre mutazioni somatiche di tale gene rappresentano
il primo evento nella evoluzione del carcinoma sporadico del colon. La maggior parte delle
mutazioni di APC sono mutazioni che coinvolgono pochi nucleotidi e determinano proteine
tronche.
Studi recenti hanno però dimostrato che circa il 10% di individui con FAP presentano estese
delezioni che interessano APC ed è stato riportato anche qualche caso di estese duplicazioni
(variazioni di “copy number”).
Il test molecolare viene eseguito mediante tecnica MLPA.
MUTYH/ Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP) e Poliposi Adenomatosa Familiare
Attenuata (AFAP)
Mutazioni germinali bialleliche nel gene MUTYH, situato sul cromosoma 1p34.1 e codificante
per una proteina di escissione di basi coinvolta nella riparazione del DNA, rappresentano un
fattore predisponente per FAP e per AFAP.
Le mutazioni p.Y165C nell’esone 7, p.G382D nell’esone 13 e p.E466del nell’esone 14 presenti
in omozigosi o in eterozigosi composta, rappresentano circa l’80% delle mutazioni causative
nella popolazione caucasica.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 7, 13 e 14 del gene MUTYH.
HOXB13
La mutazione p.G84E nel gene rappresenta un fattore di rischio significativo per lo sviluppo
del cancro alla prostata. La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante
sequenziamento diretto dell’esone 1 del gene HOXB13.
CDKN2A
Mutazioni germinali nel gene CDKN2A, situato sul cromosoma 9p21 e codificante per un
oncosoppressore che regola il ciclo cellulare inducendo arresto del ciclo cellulare,
rappresentano un fattore predisponente per cancro al pancreas e melanoma.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale degli esoni codificanti le due
isoforme proteiche p16 e p14 mediante sequenziamento diretto degli esoni del gene
CDKN2A.
DIAGNOSI MOLECOLARE DI OLIGO/AZOOSPERMIA
MICRODELEZIONE CROMOSOMA Y
L’infertilità è un problema che interessa il 15-20 % di tutte le coppie ed in circa la metà dei
casi è di tipo maschile. In molti di questi casi sono identificabili microdelezioni a carico del
cromosoma Y, responsabili di oligo/azoospermia.
Questo tipo di analisi, associato alla ricerca di anomalie cromosomiche ed allo screening per
fibrosi cistica è in grado di individuare sia cause genetiche di infertilità maschile che la loro
possibilità di trasmissione in seguito a pratiche di fecondazione assistita.
Il test molecolare è indicato per:
• maschi oligo/azoospermici
• fecondazione assistita (ICSI)
• infertilità maschile
Il test viene eseguito con multiplex-PCR e successiva elettroforesi su gel di agarosio (sec.
Kent-First, 1999).
TEST DI FARMACOGENETICA/VALUTAZIONE DI MARCATORI BIOLOGICI
MOLECOLARI DIAGNOSTICI E PROGNOSTICI
L’insorgenza di resistenza/intolleranza ai farmaci (chemioterapici, antiinfiammatori, etc) è
uno dei principali ostacoli al successo dei trattamenti. L’individuazione di caratteristiche
specifiche di un individuo permettono di predire la possibile insorgenza di
resistenza/intolleranze a tali trattamenti e rappresenta pertanto una informazione
fondamentale per l’individuazione della terapia da seguire.
Risposta terapeutica a gefitinib/erlotinib (EGFR)
Il test molecolare permette di individuare mutazioni a carico degli esoni 18, 19, 21 del gene
EGFR. In particolare vengono ricercate le mutazioni associate a risposta terapeutica a
Gefitinib (Ref. bibliografiche: NEJM, 2004; 350:2129-2139 / Science, 2004;304:1497-1500).
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 18, 19, 21 del gene EGFR.
Effetti collaterali da irinotecan (UGT1A1)
Il test molecolare permette di individuare il polimorfismo A(TA)6TAA/A(TA)7TAA a carico del
promotore del gene UGT1A1.
I genotipi A(TA)6/7TAA A(TA)7/7TAA sono associati a tossicità per Irinotecan.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
della regione del promotore del gene UGT1A1.
Risposta terapeutica a cetuximab/panitumumab (Kras-BRAF-PIK3CA)
L’attivazione del proto-oncogene ras mediante mutazioni puntiformi rappresenta una delle
più frequenti alterazioni genetiche associate con lo sviluppo neoplastico.
Mutazioni a livello dei geni ras sono state riscontrate in diversi tipi di tumori, quali tumori
pancreatici, al colon ed ai polmoni.
Inoltre, le mutazioni a carico dei codoni 12 e 13 del gene kras rappresentano un marcatore
predittivo della risposta clinica all’impiego di anticorpi anti-EGFR nel carcinoma metastatico
del colon-retto.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
dell’esone 2 del gene kras.
Il prodotto del gene BRAF, una delle isoforme di RAF (Raf-1, A-Raf, B-Raf) è un effettore di
RAS. Mutazioni somatiche nel gene BRAF, in particolare la mutazione oncogenetica
c.1799T>A, p.V600E nell’esone 15, sono state identificate nei melanomi (75%), PTC
(Papillary Thyroid Carcinoma) (45%), carcinomi ovarici (14%) e del colonretto (10%).
Esistono forti evidenze che lo stato mutazionale del gene BRAF rappresenti un marcatore
utilizzabile per valutare l’efficacia del trattamento anti-EGFR all’interno di una analisi multipla
(K-ras e BRAF).
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
dell’esone 15 del gene BRAF.
Mutazioni nel gene PIK3CA rappresentano una delle cause nella tumorigenesi di vari tumori
ed in particolare sono state individuate nel 10-30% dei casi di cancro colorettale. In questo
ultimo caso le mutazioni sono perlopiù localizzate negli esoni 9 e 20.
Esistono forti evidenze che lo stato mutazionale del gene PIK3CA rappresenti un marcatore
utilizzabile per valutare l’efficacia del trattamento anti-EGFR all’interno di una analisi multipla
(Kras-BRAF-PIK3CA).
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 9 e 20 del gene PIK3CA.
Risposta terapeutica a farmaci metabolizzati da enzimi del citocromo P450
Nell’uomo, il metabolismo epatico del farmaco è suddiviso in due componenti: reazioni di
fase I e reazioni di fase II.
Ci sono almeno 30 famiglie di enzimi che metabolizzano farmaci e quasi tutti mostrano
polimorfismi.
Più di tre quarti degli enzimi di fase I fanno parte della famiglia di citocromo P450 e sono
indicati con CYP. La superfamiglia di enzimi del citocromo P450 (CYP450) costituisce il
principale catalizzatore delle reazioni di biotrasformazione dei farmaci. Nell’uomo sono state
identificate 18 famiglie e 43 sottofamiglie ognuna comprendente circa 50 isoforme ciascuna
delle quali è il prodotto di un singolo gene e possiede uno specifico spettro di substrati.
La diversità è dovuta a variazioni genetiche (duplicazioni, delezioni, SNPs) nei geni che
codificano per le isoforme del CYP450; in particolare le isoforme CYP2C9, CYP2C19 e CYP2D6
sono coinvolte nel metabolismo della maggior parte dei farmaci attualmente utilizzati.
Mutazioni nei geni CYP possono produrre isoforme con attività enzimatica assente, ridotta o
aumentata che determinano 4 distinti fenotipi/metabolizzatori:
• lenti-PM (poor metabolizers) privi di enzimi funzionali
• intermedi-IM (intermediate metabolizers) eterozigoti per la presenza di un gene
mutato (enzima non funzionale
• rapidi-EM (extensive metabolizers) omozigoti geni funzionali
• ultrarapidi-UR (ultrarapid metabolizers) più di due geni funzionali
Il CYP2C19 catalizza il metabolismo degli antidepressivi imipramina, amitriptilina,
clomipramina, citalopram e moclobemide, così come quello del diazepam, del
desmetildiazepam, dell’omeprazolo, del proguanil e della mefenitoina.
Il CYP2D6 è uno dei più importanti isoenzimi coinvolti nel metabolismo dei farmaci e sebbene
sia quantitativamente uno dei meno rappresentati (< 5% del totale), catalizza l’ossidazione
di più di 30 farmaci: per quanto riguarda i farmaci anticancro, CYP2D6 è coinvolto solamente
nella conversione del tamoxifene al 50 volte più potente antiestrogenico 4OH-tamoxifene ed
endoxifene.
Il test molecolare viene eseguito in Real Time PCR.
Resistenza all’Aspirina
Il test molecolare permette di individuare eventuali sostituzioni aminoacidiche a livello della
proteina prodotta dal gene GPIIIa.
La metodica impiegata prevede PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel di
agarosio.
Instabilità dei microsatelliti (MSI) come marcatore biologico
Esistono due modelli distinti nella progressione del cancro gastrointestinale definiti da due
tipi di instabilità genomica: instabilità cromosomica (CIN) ed instabilità dei microsatelliti
(MSI) associata ad un “pathway mutante”; tale fenotipo si trova nel 15% di CCR sporadico
ed è caratterizzato da piccole inserzioni e delezioni in sequenze di microsatelliti che ne
causano alterazioni nella lunghezza; all’MSI pathway sono riconducibili anche tumori
(endometrio e meno frequentemente stomaco, vie urinarie, vie biliari, ovaio, piccolo
intestino, pancreas ed altri) associati a Sindrome di Lynch (HNPCC: Hereditary Non Poliposic
Colorectal Cancer) ed alcuni tumori gastrointestinali ed endometriali. Tale predisposizione
ereditaria allo sviluppo di cancro colpisce 1/200-1000 individui ed è caratterizzata da precoce
età di insorgenza.
La analisi della instabilità dei microsatelliti prevede analisi di frammenti ottenuti per
amplificazione contenenti corte sequenze ripetute di mono, di, tetra e pentanucleotidi.
Criteri di definizione:
• MSI-H se instabilità >30% dei loci analizzati (2 o più dei markers utilizzati)
• MSI-L se instabilità <30% dei loci analizzati (1 dei markers utilizzati)
• MSS se assenza di instabilità
Essa rappresenta un marcatore biologico diagnostico ed inoltre esistono anche forti evidenze
di prognosi migliore per pazienti con MSI-H rispetto a MSI-L o MSS.
La metodica impiegata prevede PCR e successiva elettroforesi capillare .
BRAF come marcatore biologico
Il prodotto del gene BRAF, una delle isoforme di RAF (Raf-1, A-Raf, B-Raf) è un effettore di
RAS. Mutazioni nel gene BRAF,
in particolare la mutazione oncogenetica c.1799T>A, p.V600E nell’esone 15, sono state
identificate nei melanomi (75%), PTC (Papillary Thyroid Carcinoma) (45%), carcinomi ovarici
(14%) e del colonretto (CCR) (10%).
Mutazioni nel gene BRAF, vengono più frequentemente identificatea nei CCR con MSI-H (2030%) rispetto a quelli con MSS (5-10%) ed ancora mutazioni nel gene BRAF non sono mai
state identificate nei pazienti con Sindrome di Linch (HNPCC).
Lo stato mutazionale del gene BRAF rappresenta quindi un utile marcatore biologico
diagnostico.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
dell’esone 15 del gene BRAF.
c-kit come marcatore biologico
L’insorgenza di mutazioni nel proto-oncogene c-kit (codificante per un recettore di
membrana tirosin chinasico) determina un’attivazione costitutiva del recettore e rappresenta
una tappa fondamentale nello sviluppo di vari tumori fra cui i tumori stromali gastrointestinali
(GIST). Il 90% dei GIST presenta mutazioni in c-kit ed in particolare esse sono localizzate
negli esoni 9, 11, 13 e 17.
Lo stato mutazionale del gene c-kit rappresenta quindi un utile marcatore biologico
diagnostico.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 9, 11, 13 e 17 del gene c-kit
Marcatori biologici molecolari prognostici nella leucemia mieloide acuta (LAM)
(FLT3, NPM1, CBL, WT1)
Il 40%-45% dei pazienti affetti da LAM appartengono al sottogruppo NC-LAM (pazienti affetti
da LAM con cariotipo normale). Tali pazienti esibiscono usualmente due o più alterazioni di
tipo genetico molecolare e la loro identificazione assume un significato prognostico e risulta
utile ai fini della scelta terapeutica.
Attualmente le indagini molecolari prevedono la ricerca di mutazioni in geni coinvolti nei
meccanismi di regolazione della proliferazione, dello sviluppo e del differenziamento delle
cellule progenitrici ematopoietiche.
Mutazioni nel gene codificante la proteina FLT3, un recettore tirosin kinasico, portano alla
sua attivazione costitutiva e conseguentemente a proliferazione incontrollata delle cellule
progenitrici ematopoietiche. Due sono le mutazioni presenti con maggiore frequenza nelle
NC-LAM: duplicazioni in tandem del dominio juxstamembrana di FLT3 situate in
corrispondenza degli esoni 14 e 15 e mutazioni puntiformi nell’esone 20 in corrispondenza
del codone D835 nel dominio tirosin kinasico di FLT3.
Le metodiche impiegate prevedono amplificazione mediante PCR degli esoni 14 e 15 e
successiva elettroforesi su gel agarosio Nusieve e una analisi mutazionale mediante
sequenziamento diretto dell’esone 20 del gene FLT3.
La proteina NPM1 è una fosfoproteina nucleolare che lega l’RNA ed è coinvolta nel trasporto
delle ribonucleoproteine tra nucleo e citoplasma. Mutazioni nell’esone 12 del gene NPM1
rappresentano la più frequente alterazione genetica nelle NC-LAM.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
dell’esone 12 del gene NPM1
Il gene CBL codifica per una proteina con attività di ubiquitina ligasi e partecipa alla
degradazione dei recettori tirosin kinasici. Le mutazioni a carico del gene sono diverse, ma
perlopiù localizzate negli esoni 8 e 9.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 8 e 9 del gene CBL.
Il gene WT1 (Wilms Tumor 1) codifica per un regolatore trascrizionale espresso nelle cellule
renali embrionali e nelle cellule staminali ematopoietiche. Sebbene sia noto che WT1 è
coinvolto nella proliferazione e differenziazione delle cellule ematopoietiche, il suo preciso
ruolo nella ematopoiesi ed il suo contributo nella leucemogenesi rimangono ancora da
definire: certamente però le mutazioni nel gene WT1 hanno significato di prognostico
avverso.
Le mutazioni nel gene WT1 hanno una frequenza del 10% nelle NC-LAM e si verificano in
corrispondenza
degli
esoni
7
e
9.
La metodica impiegata prevede una analisi mutazionale mediante sequenziamento diretto
degli esoni 7 e 9 del gene WT1.
DEFINIZIONE DEL RISCHIO DI DIFETTI DEL TUBO NEURALE
La somministrazione di acido folico a donne in periodo periconcezionale riduce l’incidenza di
DTN nella prole sino al 70%.
L’analisi dei polimorfismi dei geni CBS, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR, MTHFD1,
RFC1 è importante per definire il rischio di ricorrenza di DTN, la sua tipologia (folato-sensibile
o folato-resistente), l’approccio terapeutico/profilattico periconcezionale
Il test viene suggerito per:
• individuazione coppie a rischio per DTN
genitori con precedenti figli affetti da DTN
genitori di precedenti figli con malformazioni congenite
Il test viene eseguito con PCR, digestione enzimatica ed elettroforesi su gel di agarosio.
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