Struttura e meccanismo d`azione degli enzimi
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Macromolecole Biologiche Chimica Biologica A.A. 2010-2011 Struttura e meccanismo d’azione degli enzimi Catalisi chimica Catalisi chimica: teoria dello stato di transizione - descrizione microscopica del sistema: le molecole di reagenti per trasformarsi prodotti procedono lungo una traiettoria di reazione ⇒ questo progresso viene descritto da una coordinata di reazione “diagramma dello stato di transizione” o “diagramma della coordinata di reazione” (correla l’energia libera alla coordinata di reazione) il punto di massima G corrisponde allo stato di transizione (o complesso attivato) Catalisi chimica Catalisi chimica: teoria dello stato di transizione A + B → X‡ → P A, B = reagenti P = prodotto X‡ = stato di transizione punto della reazione corrispondente al max di energia libera Coordinata di reazione: percorso di minima energia libera lungo il quale i reagenti si avvicinano l’un l’altro ΔGreazione< 0 ⇒ reazione spontanea ΔG‡ = energia libera di attivazione Catalisi chimica Correlazione tra velocità di una reazione ed energia di attivazione K‡ A, B = reagenti P = prodotto k’ ⇀ X‡ → P A+B↽ k A+B→P velocità della reazione: d[P] = k [A][B] = k’ [X‡] dt k = costante di velocità ordinaria della reazione elementare k’ = costante di velocità di decomposizione di X‡ nei prodotti assunzione: anche se instabile, X‡ è in rapido equilibrio con i reagenti ‡] [X ⇒ K‡ = [A][B] costante di equilibrio ⇒ ⇒ K‡ può essere espressa come: -RT ln K‡ = ΔG‡ Catalisi chimica Correlazione tra velocità di una reazione ed energia di attivazione d[P] = k [A][B] = k’ [X‡] = k’ K‡ [A][B] = k’ exp (-ΔG‡/RT) [A][B] dt ⇒ la velocità di reazione non dipende solo dalla concentrazione dei reagenti ma diminuisce in modo esponenziale con ΔG‡ (differenza tra l’energia libera dello stato di transizione e quello dei reagenti) maggiore è ΔG‡ ⇒ meno stabile è lo stato di transizione ⇒ più lenta è la reazione k = k’ exp (-ΔG‡/RT) = (KBT/h) exp (-ΔG‡/RT) KB = costante di Boltzmann = 1.3807 1023 J K-1 h = costante di Plank = 6.6261 10-34 J s R = costante dei gas = 8.31 J mol-1 K-1 Catalisi chimica Correlazione tra velocità di una reazione ed energia di attivazione K‡ k’ A+B ↽ ⇀ X‡ → P k’ = costante di velocità di decomposizione di X‡ nei prodotti lo stato di transizione è stabilizzato da un legame debole che può rompersi alla prima escursione vibrazionale k’ = κν ν = frequenza vibrazionale del legame che si spezza quando X‡ si decompone κ = coeff. di trasmissione (0-1) (probabilità che la rottura di sia nella direzione della formazione del prodotto) Catalisi chimica Correlazione tra velocità di una reazione ed energia di attivazione K‡ k’ A+B ↽ ⇀ X‡ → P k’ = κν ν = ε/h ε = energia media della vibrazione che porta alla decomposizione di X‡ h = costante di Plank ad una temperatura T l’energia classica di un oscillatore è ε = KBT (energia termica disponibile) KB = costante di Boltzmann ⇒ k’ = κν = KBT/h ⇒ k = k’ exp (-ΔG‡/RT) = (KBT/h) exp (-ΔG‡/RT) si assume κ = 1 all’aumentare di T e quindi dell’energia termica disponibile, aumenta la velocità della reazione Catalisi chimica Correlazione tra velocità di una reazione ed energia di attivazione - passaggio attraverso lo stato di transizione: 10-13 -10-14 s - la decomposizione dello stato di transizione nei prodotti (o viceversa, nei reagenti) è il processo che determina la velocità di reazione totale A→I→P I = intermedio di reazione 2 stati di transizione 2 energie di attivazione - la tappa con lo stato di transizione a maggior energia libera determina la velocità di reazione Catalisi chimica I catalizzatori riducono l’energia libera di attivazione I catalizzatori si combinano temporaneamente con i reagenti promuovendo così il loro ingresso nella condizione reattiva dello stato di transizione • abbassano il ΔG‡ • non alterano ΔGreazione (reazione spontanea diretta se ΔGreazione < 0, altrimenti inversa) • accelerano allo stesso modo la reazione diretta e quella inversa (la reazione raggiunge l’equilibrio più velocemente) ΔΔG‡cat = efficienza del catalizzatore = ΔG‡noncat -ΔG‡cat Catalisi chimica I catalizzatori riducono l’energia libera di attivazione d[P] = k’ exp (-ΔG‡/RT) [A][B] dt aumento di velocità: rapporto fra velocità di reazione catalizzata e non catalizzata exp(-ΔG‡cat /RT) / exp(-ΔG‡noncat /RT) = exp(ΔG‡noncat -ΔG‡cat)/RT = exp(ΔΔG‡cat) dove ΔΔG‡cat = efficienza del catalizzatore Esempio: a T = 25 °C (298 K) aumento di velocità di 10 volte ⇒ ΔΔG‡ ~ 5.71 kJ/mol (meno della metà dell’energia libera di un tipico legame a idrogeno) aumento di velocità di 106 volte ⇒ ΔΔG‡ ~ 34 kJ/mol (piccola frazione dell’energia libera della maggior parte dei legami covalenti) Catalisi chimica I catalizzatori riducono l’energia libera di attivazione si consideri la conversione di A in P: kF ⇀ A↽ P kR se in assenza di un catalizzatore la costante di velocità da A a P è, per esempio, kF 10-4 s-1 mentre la costante di velocità della reazione inversa è kR 10-6 s-1 ⇒ la costante di equilibrio è K = kF / kR = [P]/[A] = 100 ⇒ all’equilibrio la concentrazione di P è 100 volte quella di A tale valore non cambia se la reazione è catalizzata, ma l’equilibrio si raggiunge più in fretta Proprietà generali degli enzimi Catalisi enzimatica - le diverse proteine svolgono funzioni biologiche cui si fa riferimento col termine di attività biologica: ogni specie proteica ha una propria attività biologica - gli enzimi sono i catalizzatori biologici - l’attività biologica di un enzima è una specifica attività catalitica: capacità di accelerare una determinata reazione chimica - gli enzimi aumentano la velocità delle reazioni chimiche abbassando la barriera di energia libera che separa i reagenti dai prodotti - i reagenti di una reazione catalizzata da un enzima sono detti substrati di quell’enzima Proprietà generali degli enzimi Interazioni enzima-ligandi nella trasformazione del substrato in prodotto - gli enzimi agiscono legando transientemente substrati, intermedi, stati di transizione, e prodotti della reazione catalizzata - la reazione avviene con queste varie specie che si trasformano da reagenti in prodotti mantenendosi in complesso con l’enzima - l’enzima crea un ambiente in cui lo stato di transizione è stabilizzato e in cui la reazione procede quindi più velocemente di quando avviene quando le specie coinvolte sono in forma libera Proprietà generali degli enzimi Interazioni enzima-ligandi nella trasformazione del substrato in prodotto una reazione catalizzata enzimaticamente procede con un meccanismo diverso da quella non catalizzata, con stati di transizione aventi una ΔG‡ inferiore Proprietà generali degli enzimi Catalisi chimica e catalisi enzimatica - gli enzimi catalizzano specifiche reazioni chimiche attraverso meccanismi di per sé molto simili a quelli operanti nella normale catalisi chimica - il meccanismo catalitico di un enzima è sempre una combinazione di più meccanismi elementari di catalisi chimica - il processo catalitico di un enzima interessa principalmente una porzione della molecola della proteina enzimatica, detta sito attivo - nel sito attivo sono presenti vari gruppi funzionali, detti gruppi catalitici, disposti e orientati in modo opportuno per legare i substrati e promuovere la loro trasformazione nei prodotti Proprietà generali degli enzimi queste reazioni di fatto non - le reazioni catalizzate dagli enzimi sono: avvengono senza catalizzatore • 106-1014 volte più veloci delle reazioni non catalizzate • alcuni ordini di grandezza più veloci delle reazioni catalizzate chimicamente Proprietà generali degli enzimi Differenze rispetto ai normali catalizzatori chimici (1) velocità di reazione più elevate (2) condizioni di reazione più blande: T < 100 °C, P = Patm, pH ~ neutro (una catalisi chimica efficiente invece può richiedere T e P elevate e pH estremi) (3) capacità di regolazione: - controllo allosterico - modificazione covalente degli enzimi - variazione della quantità di enzima sintetizzato (4) elevata specificità di reazione: nel riconoscimento dei substrati e prodotti (raramente si hanno prodotti collaterali) Proprietà generali degli enzimi (4) elevata specificità di reazione i substrati (ed altre molecole) si legano ai siti attivi (cavità interne o fessure superficiali) degli enzimi mediante interazioni non-covalenti - complementarità geometrica - complementarità elettronica - modelli per l’interazione enzima-substrato: • modello chiave-serratura • modello dell’adattamento indotto - in realtà il sito attivo più che essere complementare al substrato, è complementare allo stato di transizione Proprietà generali degli enzimi • Modello chiave-serratura siti di legame pre-strutturati, complementarità fra sito attivo enzima e substrato e nessun cambio conformazionale dovuto al legame del substrato • Modello dell’adattamento indotto siti di legame pre-strutturati, ma cambi conformazionali dovuti al legame del substrato Proprietà generali degli enzimi (4) elevata specificità di reazione (4a) stereospecificità - specificità nel legare substrati chirali e nel catalizzare le loro reazioni - intrinseca asimmetria dei siti attivi (formati solo da L-AA) - quasi tutti gli enzimi che partecipano a reazioni chirali sono assolutamente stereospecifici Esempio: Aconitasi (ciclo dell’acido citrico) Citrato = molecola prochirale ⇒ diventa chirale per sostituzione di uno dei 2 gruppi carbossimetilici –CH2COO⇒ interazione asimmetrica (su 3 punti) fra citrato ed enzima Proprietà generali degli enzimi (4) elevata specificità di reazione (4b) specificità geometrica - selettività nel riconoscimento dell’identità dei gruppi chimici dei substrati - gli enzimi possono avere una specificità geometrica molto variabile - “preferenza” (più che specificità geometrica) quando i substrati accettati sono svariati (esempio: gli enzimi digestivi) Esempio: Chimotripsina mancanza di specificità anche per il tipo di reazione catalizzata (eccezione alla regola) ⇒ idrolisi di legame peptidico ed estere Proprietà generali degli enzimi Nomenclatura degli Enzimi IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology): organismo internazionale che si occupa della classificazione funzionale e sistematica degli enzimi e della loro denominazione http://www.iubmb.unibe.ch - classificazione e denominazione in base alla reazione catalizzata - ad ogni enzima sono assegnati 2 nomi e 1 numero: Nome d’uso raccomandato (nome comunemente usato, spesso di origine “storica”) Nome sistematico (nome dei substrati + termine con suffisso –asi, che definisce il tipo di reazione) Numero di classificazione Proprietà generali degli enzimi Nomenclatura degli Enzimi Numero di classificazione formato: (EC X.Y.Z.W) esempio: EC 1.1.1.1 “EC”: Enzyme Commission X: Classe Y: Sottoclasse Z: Sotto-sottoclasse W: numero individuale - esistono 6 classi principali di reazioni enzimatiche Proprietà generali degli enzimi Nomenclatura degli Enzimi Classe di enzimi Reazioni catalizzate 1. Ossidoriduttasi Reazioni di ossidoriduzione 2. Transferasi Trasferimento di gruppi funzionali 3. Idrolasi Reazioni di idrolisi Reazioni di eliminazione con formazione di doppi legami Isomerizzazioni Formazione di legami accoppiata all’idrolisi di ATP 4. Liasi 5. Isomerasi 6. Ligasi Proprietà generali degli enzimi Nomenclatura degli Enzimi Proprietà generali degli enzimi Nomenclatura degli Enzimi Esempi: alcool deidrogenasi alcool:NAD+ ossidoriduttasi EC 1.1.1.1 (nome raccomandato) (nome sistematico) (numero di classificazione) carbossipeptidasi A peptidil-L-amminoacido-idrolasi EC 3.4.17.1 (nome raccomandato) (nome sistematico) (numero di classificazione) Cofattori Cofattori e Coenzimi i gruppi funzionali delle proteine sono molto adatti per: - partecipare a reazioni acido-base - formare legami covalenti transitori - partecipare ad interazioni carica-carica meno adatti per: - catalizzare reazioni di ossidoriduzione - catalizzare processi con trasferimenti di gruppi Cofattori ⇒ molti enzimi agiscono con l’ausilio di specifiche sostanze non peptidiche: i cofattori Cofattori Cofattori e Coenzimi Ioni metallici (Cu2+, Fe3+, Zn2+) Cofattori Cosubstrati Coenzimi (molecole organiche) Gruppi prostetici Cosubstrati: sono associati transientemente all’enzima e quindi funzionano da cosubstrati Gruppi prostetici: sono permanentemente associati all’enzima, spesso anche con legami covalenti “Oloenzima”= complesso enzima-cofattore cataliticamente attivo “Apoenzima”= proteina inattiva a seguito della rimozione del cofattore Cofattori Ioni metallici - effetti tossici di alcuni ioni metallici: Cd2+ e Hg2+ possono sostituire lo Zn2+ (stesso gruppo della tavola periodica ) nel sito attivo di certi enzimi inattivandoli Cofattori Coenzimi a) I coenzimi devono essere rigenerati - per completare un ciclo catalitico, i coenzimi che vengono modificati chimicamente devono tornare al loro stato originale cosubstrati ⇒ la reazione può essere catalizzata da un enzima diverso gruppi prostetici ⇒ la reazione avviene come fase (separata) della sequenza della reazione enzimatica Cofattori Coenzimi Esempio: NAD+ e NADP+ trasportatori intracellulari di elettroni Riduzione: trasferimento di 2 atomi di idrogeno H· o di uno ione idruro H:- e di un protone H+ ADH = alcool deidrogenasi Cofattori Coenzimi b) Molte vitamine sono precursori di coenzimi - molti organismi non sono in grado di sintetizzare alcuni coenzimi o parti di essi ⇒ tali parti sono introdotti con la dieta attraverso le vitamine - negli organismi superiori i meccanismi di sintesi delle vitamine sono andati persi evolutivamente - solo le vitamine idrosolubili sono precursori di cofattori (non quelle liposolubili come la vitamina A e D) Cofattori Coenzimi b) Molte vitamine sono precursori di coenzimi Cofattori Coenzimi b) Molte vitamine sono precursori di coenzimi Meccanismi di Catalisi Meccanismi di Catalisi • i catalizzatori riducono l’energia libera dello stato di transizione ΔG‡ stabilizzando lo stato di transizione della reazione catalizzata • l’efficienza degli enzimi è dovuta alla loro specificità nel legare i substrati combinata alla disposizione dei gruppi catalitici classificazione meccanismi di catalisi 1) Catalisi acido-base 2) Catalisi covalente 3) Catalisi favorita da ioni metallici 4) Effetti di prossimità e orientamento 5) Legame preferenziale dello stato di transizione Meccanismi di Catalisi Catalisi acido-base • Catalisi acida generale l’energia libera dello stato di transizione di una reazione viene abbassato a seguito del trasferimento temporaneo di un protone da un acido Esempio: tautomerizzazione cheto-enolica reazione non catalizzata reazione lenta: elevata energia libera dello stato di transizione, simile ad un carbanione catalisi acida generale donazione di un protone all’atomo di O ⇒ riduzione del carattere carbanionico dello stato di transizione ⇒ aumento velocità reazione Meccanismi di Catalisi Catalisi acido-base • Catalisi basica generale l’energia libera dello stato di transizione di una reazione viene abbassato a seguito della sottrazione temporanea di un protone da parte di una base Esempio: tautomerizzazione cheto-enolica reazione non catalizzata catalisi basica generale Meccanismi di Catalisi Catalisi acido-base • reazioni acido-basiche catalizzate in modo concertato reazioni soggette contemporaneamente a catalisi acida e basica generale • le catene laterali di Asp, Glu, His, Cys, Tyr e Lys hanno un valore di pK nell’ambito del pH fisiologico ⇒ possono agire come catalizzatori acidi e/o basici • l’attività catalitica di questi enzimi è sensibile al pH (influenza sullo stato di protonazione delle catene laterali ) ⇒ andamento a campana della velocità della reazione catalizzata in funzione del pH ⇒ molti enzimi sono attivi nell’ambito di un ristretto valore di pH (5-9) Meccanismi di Catalisi Catalisi acido-base • un gruppo ionizzabile sarà più efficiente nel trasferire protoni a pH prossimi al suo pK tuttavia il pK di un gruppo può variare di diverse unitàda quello atteso, a seconda del microambiente in cui si trova • il pH, oltre che sullo stato di ionizzazione delle catene laterali, ha influenza anche su: - il legame del substrato all’enzima - la ionizzazione del substrato - le variazioni strutturali dell’enzima Meccanismi di Catalisi Residui implicati nella catalisi acido-base pKa ~4 ~10-12.5 ~8.3 ~6 ~10 Meccanismi di Catalisi Esempio di reazione acido-base concertata RNasi A (pancreas bovino) • enzima digestivo (secreto dal pancreas nell’intestino tenue) • idrolisi di RNA nei nucleotidi componenti • velocità di reazione pH-dipendente ⇒ coinvolgimento di 2 residui ionizzabili con pK 5.54 e 6.4 (2 residui His) RNasi S (forma attiva, legame peptidico 20-21 idrolizzato) + analogo del substrato non digeribile Meccanismi di Catalisi Esempio di reazione acido-base concertata Reazione 1: His 12 (base generale) sottrae un protone dal gruppo ossidrile 2’ dell’RNA, promuovendo l’attacco nucleofilico all’atomo di fosforo His 119 (acido generale) promuove la scissione del legame protonando il gruppo uscente ⇒ formazione di un intermedio poliribonuleotidico contenente un gruppo fosfodiestere 2’,3’-ciclico all’estremità 3’-terminale Reazione 2: dopo che il gruppo uscente si allontana entra H2O His 12 (acido generale), His 119 (base generale) Meccanismi di Catalisi Catalisi covalente • la reazione viene accelerata mediante la formazione transitoria di un legame covalente fra il catalizzatore (gruppo nucleofilico) ed il substrato (gruppo elettrofilico) ⇒ “catalisi nucleofilica” 3 tappe concettuali: 1. formazione del legame covalente catalizzatore-substrato mediante reazione nucleofilica 2. perdita di elettroni dal centro di reazione ad opera del catalizzatore (ora elettrofilico) 3. eliminazione del catalizzatore (reazione inversa della 1.) Meccanismi di Catalisi Catalisi covalente • la nucleofilicità di una sostanza è correlata alla sua basicità ⇒ la catalisi covalente assomiglia a quella basica salvo il fatto che si forma un legame covalente invece della privazione di un H+ dal substrato • più stabile è il legame covalente più sarà difficile romperlo e proseguire nella catalisi ⇒ un “buon catalizzatore covalente” deve combinare 2 proprietà apparentemente contraddittorie: (a) alta nucleofilicità (b) capacità di formare un gruppo che abbandoni facilmente l’enzima • gli intermedi covalenti formano il prodotto desiderato reagendo in un secondo passaggio della reazione con: (a) una molecola di acqua (b) un secondo substrato Meccanismi di Catalisi Catalisi covalente Gruppi nucleofilici: - carichi negativamente - contengono coppie di e- non condivisi in grado di formare facilmente legami covalenti con centri poveri di elettroni Esempi: Proteine gruppo amminico non protonato (Lys), gruppo carbossilico (Asp), gruppo imidazolico (His), gruppo tiolico (Cys), gruppo ossidrilico (Ser) Coenzimi tiamina pirofosfato (fermentazione alcolica) piridossal fosfato (deamminazione a.a.) Meccanismi di Catalisi Catalisi covalente Centri elettrofilici dei substrati: - gruppi carichi positivamente guscio elettronico di valenza non completo atomi elettronegativi Esempi: gruppo fosforico, gruppo acilico, gruppo glicosilico Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita da ioni metallici • ~ 1/3 degli enzimi richiede ioni metallici per l’attività catalitica metalloenzimi: metalli di transizione (Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Co2+) legati saldamente all’enzima ⇒ ruolo catalitico enzimi attivati da metalli: metalli alcalini, alcalini-terrosi (Na+, K+, Mg2+, Ca2+) legati debolmente all’enzima ⇒ ruolo strutturale • 3 diversi possibili ruoli catalitici: 1) si legano al substrato orientandolo correttamente per la reazione 2) partecipano a reazioni di ossido-riduzione mediante cambiamento reversibile del loro numero di ossidazione 3) stabilizzano elettrostaticamente o proteggono le cariche negative (o l’aumento di densità elettronica) che possono svilupparsi durante la reazione Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita da ioni metallici - in molte reazioni si comportano come un protone che neutralizza una carica negativa, ma sono più efficienti perché possono essere più concentrati a pH neutro (dove [H+] = 10-7M) e con carica > +1. - rendono più acide le molecole d’acqua ad essi legate, cioè le rendono fonte di ioni idrossido OH− nucleofilici anche a valori di pH minori della neutralità Esempio: Anidrasi carbonica CO2 + H2O HCO3− + H+ Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita da effetti di prossimità e orientamento I reagenti devono venire in contatto nella giusta relazione spaziale 1) gli enzimi portano i substrati in contatto con i gruppi catalitici e, in reazioni a più substrati, i substrati fra loro ⇒ aumento velocità di un fattore ~5 2) gli enzimi legano i substrati nelle orientazioni più produttive affinché la reazione abbia luogo ⇒ aumento velocità di un fattore ~100 (diversa reattività delle molecole a seconda della loro orientazione. Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita da effetti di prossimità e orientamento 3) gruppi carichi possono aiutare a stabilizzare lo stato di transizione della reazione (“catalisi elettrostatica”) e possono guidare substrati polari verso il sito attivo 4) gli enzimi stabilizzano/bloccano i movimenti (traslazionali e rotazionali) relativi tra i substrati ed i gruppi catalitici (nello stato di transizione) ⇒ aumento di velocità di un fattore fino a ~107) Penalizzazione entropica: diminuzione di entropia dovuta all’avvicinamento reciproco ordinato di substrati e gruppi catalitici con formazione di orientamento reattivo ⇒ l’energia libera necessaria per superare tale diminuzione di entropia è fornita dall’energia di legame del(i) substrato(i) all’enzima (valori negativi di ΔΗ) Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita dal legame preferenziale dello stato di transizione - un enzima può legare lo stato di transizione con una affinità maggiore rispetto a quella dei suoi substrati e prodotti ⇒ ne aumenta la concentrazione e quindi proporzionalmente la velocità di reazione - gli enzimi forzano i substrati verso la geometria dello stato di transizione mediante siti di legame nei quali i substrati non distorti non si legano perfettamente ΔΔG‡cat = efficienza del catalizzatore = ΔG‡noncat -ΔG‡cat = ΔG‡N -ΔG‡E exp(ΔΔG‡cat /RT) = aumento di velocità di reazione Meccanismi di Catalisi Catalisi favorita dal legame preferenziale dello stato di transizione aumento di velocità di 106 volte a 25 °C ⇒ ΔΔG‡ ~ 34 kJ/mol se lo stato di transizione viene stabilizzato con soli 2 legami a H in più, non presenti fra enzima e substrato ⇒ affinità di legame per lo stato di transizione 106 volte > che al substrato - un buon substrato non deve necessariamente legarsi con alta affinità al suo enzima, ma lo farà dopo essere stato attivato a stato di transizione - gli analoghi dello stato di transizione sono potenti inibitori dell’enzima
