Biotecnologie applicate alla progettazione e
sviluppo di molecole biologicamente attive
A.A. 2010-2011
Modulo di Biologia Strutturale
Catalisi
Marco Nardini
Dipartimento di Scienze Biomolecolari e Biotecnologie
Università di Milano
Enzimi e catalisi
• Enzimi = catalizzatori = sostanza che accelera una reazione chimica senza essere
essa stessa modificata in modo permanente nel processo
(possibili modificazioni transitorie con rigenerazione finale dell’enzima)
• accelerazione sia della reazione diretta che inversa
⇒ aumento della velocità con cui si raggiunge l’equilibrio, ma non alterazione delle
concentrazioni finali di reagente/prodotto o della costante di equilibrio
• Enzimi = proteine e ribozimi (es: rRNA)
• accelerazioni dell’ordine di >109
⇒ vita organismi a T moderate
• enzimi primordiali poco efficienti
funzionalità acquisita evolutivamente mediante
mutazioni casuali (miliardi anni)
⇒ organismi viventi più antichi termofili estremi
Enzimi e catalisi
Esempio: Orotidina 5’-monofosfato decarbossilasi
• decarbossilazione fondamentale nella
biosintesi delle purine
• reazione non catalizzata
⇒ stima 78 milioni di anni per essere completata
per metà
• reazione catalizzata
⇒<1s
• aumento velocità di 1017 volte
Proprietà generali degli enzimi
Differenze rispetto ai normali catalizzatori chimici
(1) velocità di reazione più elevate
(2) condizioni di reazione più blande: T < 100 °C, P = Patm, pH ~ neutro
(una catalisi chimica efficiente invece può richiedere T e P elevate e pH estremi)
(3) capacità di regolazione:
- controllo allosterico
- modificazione covalente degli enzimi
- variazione della quantità di enzima sintetizzato
(4) elevata specificità di reazione: nel riconoscimento dei substrati e prodotti
(raramente si hanno prodotti collaterali)
Enzimi e catalisi
Fattori che contribuiscono alla catalisi
• fattori di natura fisica
⇒ struttura e proprietà fisiche dell’enzima
⇒ capacità di orientare opportunamente il ligando nel sito attivo
• fattori di natura chimica
⇒ proprietà chimiche degli a.a. dell’enzima e dei cofattori (se presenti)
- stabilizzazione specie instabili
- polarizzazione di legami
- formazione addotti covalenti
Enzimi e catalisi
Energia di attivazione di una reazione
• reazione chimica ⇒ il substrato può subire riarrangiamenti
- nella stereochimica
- nella distribuzione di carica
- nella struttura covalente
se il substrato è un composto stabile, allora esiste una barriera di energia libera che si
oppone alla trasformazione
più è alta la barriera (barriera di attivazione) più è difficile che la conversione chimica
avvenga e più lenta è la reazione
si definisce stato di transizione: punto di massima energia libera nel percorso della
reazione dal substrato a prodotto
chimicamente corrisponde ad una specie che esiste per t~10-15 s (tempo di una singola
vibrazione atomica)
IMPORTANTE: è possibile che la stereochimica e la distribuzione di carica dello
stato di transizione siano diverse da quelle del substrato e del prodotto
Enzimi e catalisi
Energia di attivazione di una reazione
Per catalizzare una reazione chimica l’enzima diminuisce la barriera energetica di
attivazione. Ciò può essere fatto in vari modi.
- aumento dell’energia libera (o “stato fondamentale”) del reagente (o del prodotto, nel
caso della reazione inversa)
- diminuzione dell’energia libera dello stato di transizione (cioè sua stabilizzazione)
- presenza di più intermedi (molecole metastabili ad energia libera piuttosto alta)
⇒ lungo la reazione tutte le barriere di attivazione sono
inferiori a quella della reazione non catalizzata
Poiché TSC2 è lo stato di transizione più alto nella reazione
catalizzata, la velocità a cui i reagenti superano questa barriera
determina la velocità complessiva
Enzimi e catalisi
Destabilizzazione stato fondamentale
• legame del substrato in una conformazione meno stabile
⇒ aumento dell’energia libera del substrato verso quella dello stato di transizione
⇒ aumento della velocità di reazione attraverso la destabilizzazione dello stato
fondamentale
Esempio: Orotidina 5’-monofosfato decarbossilasi
- il gruppo carbossilato del substrato (carico -) non
interagisce con gruppi carichi + nel sito attivo ma
è situato in una tasca idrofobica
⇒ ambiente sfavorevole per substrato legato
⇒ aumento energia libera substrato legato
⇒ facilitazione trasformazione nel prodotto neutro CO2
(energia libera inferiore in un sito idrofobico rispetto al substrato)
Enzimi e catalisi
Stabilizzazione stato di transizione
• siti attivi complementari agli stati di transizione, sia nella stereochimica sia
nella configurazione di carica (o lo diventano durante la reazione)
⇒ se lo stato di transizione viene legato più strettamente del substrato allora la barriera
di attivazione viene ridotta e la reazione diventa più probabile
la complementarità per lo stato di transizione spesso implica:
- la presenza di gruppi carichi in posizioni del sito attivo in cui si
svilupperanno cariche di segno opposto durante lo stato di transizione
- la presenza di donatori/accettori di legami a H disposti in modo appropriato
⇒ i siti attivi si adattano stericamente agli stati di transizione meglio di quanto
essi facciano per i substrati
⇒ l’enzima può subire cambi conformazionali che migliorino la complementarità allo
stato di transizione una volta che si lega il substrato
Enzimi e catalisi
Specificità di legame
formazione complesso enzima-substrato
- interazioni di solito non covalenti
contatti di van der Waals fra substrato e gruppi non polari dell’enzima
complementarità fra gruppi polari e carichi intorno alla molecola legata
- costanti di dissociazione complesso enzima-substrato variabili 10-3M -10-9M
se l’enzima trattiene troppo strettamente substrato o prodotto si riduce la sua
efficienza come catalizzatore
- aumento della probabilità di contatti produttivi fra molecole interagenti, se
orientate favorevolmente a seguito del legame nel sito attivo
- siti attivi evoluti per attrarre i loro substrati in modo che la ricerca del sito
attivo non sia un processo casuale (campo elettrostatico)
- l’enzima può fornire gruppi chimici che partecipano alla catalisi (già
opportunamente orientati prima che avvenga il legame col substrato o lo
diventano dopo)
Enzimi e catalisi
Specificità di legame
Esempi:
Enzimi e catalisi
Specificità di legame
• sottositi di specificità
• sottosito di reazione
- durante la reazione catalitica parti del substrato possono subire cambiamenti in
geometria, carica e legami covalenti
- se un enzima presenta interazioni di legame con parti del substrato destinate a subire
variazioni, queste interazioni dovranno essere rotte prima che il substrato cambi
conformazione
⇒ rallentamento dell’enzima
- mutazioni nel sottosito di specificità senza influenzare il sottosito di reazione possono
consentire di operare la stessa reazione chimica su substrati molto diversi
⇒ applicazione in medicina ed industria per progettare nuovi catalizzatori
Meccanismi di Catalisi
Meccanismi di Catalisi
•
i catalizzatori riducono l’energia libera dello stato di transizione (ΔG‡ )
stabilizzando lo stato di transizione della reazione catalizzata
•
l’efficienza degli enzimi è dovuta alla loro specificità nel legare i
substrati combinata alla disposizione dei gruppi catalitici
classificazione meccanismi di catalisi
1) Catalisi acido-base
2) Catalisi covalente
3) Catalisi favorita da ioni metallici
4) Effetti di prossimità e orientamento
5) Legame preferenziale dello stato di transizione
Enzimi e catalisi
Prossimità e orientamento
• molecole di substrato intrinsecamente reattive
⇒ mantenerle vicine nella corretta orientazione può essere sufficiente per
facilitare la chimica appropriata di reazione (“fattore di prossimità” o
“fattore di vicinanza”)
Esempio: Aspartato transcarbamilasi
condensazione di carbamil fosfato ed
acido aspartato ⇒ carbamil aspartato
chimica dovuta alla reattività delle molecole
non sono presenti catene laterali chimicamente
reattive nelle vicinanze del punto in cui si forma
il legame fra i substrati
(regolazione allosterica)
Enzimi e catalisi
Esempio: fosfoglicerato chinasi
formazione di ATP e di 3-fosfoglicerato (3PG) (reazione 7 della glicolisi)
reazione: “chinasi” perché la reazione inversa è il trasferimento di un
gruppo fosforico a 3PG
Enzimi e catalisi
Esempio: fosfoglicerato chinasi
- struttura bilobata
- sito di legame Mg2+-ADP su un dominio
- sito di legame 1,3-BPG sull’altro dominio
(distanza ~10Å)
- avvicinamento dei 2 domini
⇒ creazione sito di legame per ione metallico
⇒ reazione in ambiente privo di acqua
(come nel caso dell’esochinasi, ma
strutture scorrelate)
Enzimi e catalisi
Esclusione acqua ed accessibilità
alcune reazioni chimiche non possono procedere rapidamente o non possono avvenire
del tutto in presenza di acqua
⇒ cambiamenti conformazionali che schermano il sito attivo dal contatto col
solvente
sito attivo in conformazione chiusa:
- ciò che è legato è protetto dall’acqua, ma i substrati non possono entrarvi ed i
prodotti uscirne
sito attivo in conformazione aperta:
- l’enzima non è un efficace catalizzatore
⇒ l’enzima a riposo è nello stato aperto
⇒ il legame del substrato provoca il cambio conformazionale responsabile per
la chiusura del sito attivo (può limitare la velocità di catalisi)
Enzimi e catalisi
Esclusione acqua ed accessibilità
i movimenti del coperchio sono guidati da moti termici caratteristici di tutte le
molecole in soluzione
il coperchio è tenuto chiuso solo da poche interazioni deboli col substrato e con il resto
dell’enzima. Quando tali interazioni si interrompono (accade periodicamente a T
ordinarie) il coperchio si può aprire ed il prodotto uscire
(non esiste un unico meccanismo comune a tutti gli enzimi che escludono H2O)
movimento di apertura del coperchio non deve essere troppo veloce
Es: GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi: reazione 6 della glicolisi)
- trasferimento di ~1000 ioni idruro ogni secondo ⇒ movimento 10Å ogni 10-3 s
10-10 m / 10-3 s = 36 10-13 km / 10-5 h ~ 10-6 km/h
le transizioni conformazionali di un peptide in soluzione sono 104 volte più veloci
