Diapositiva 1 - W W W . T E L E S A . ORG

Valutazione di Topoisomerasi IIα mediante tecnica FISH su
tessuto. Correlazioni con chemioterapia a base di antracicline e
farmacoresistenza.
Carmelo Lupo
Servizio di Anatomia Patologica
Casa di Cura di Alta Specialità la Maddalena
Dipartimento Oncologico di III Livello, Palermo.
DNA Topoisomerasi IIa
Le DNA Topoisomerasi sono enzimi deputati al rilassamento dei
superavvolgimenti delle catene di DNA;
nelle cellule eucariotiche ne esistono due diversi tipi:
•La DNA Topoisomerasi I è un monomero in grado di tagliare un
singolo filamento del duplex di DNA e non richiede cofattori energetici;
•La DNA Topoisomerasi II al contrario agisce come dimero, taglia entrambe i
filamenti del DNA ed è ATP dipendente.
REAZIONE DI ATTRAVERSAMENTO DELL’ELICA CATALIZZATA DALLA DNA
TOPOISOMERASI II
•
RICHIEDE IDROLISI DI ATP
•
FORMA LEGAME COVALENTE CON
ENTRAMBI I FILAMENTI
•
PERMETTE PASSAGGIO DI UNA
DOPPIA ELICA ATTRAVERSO LA
ROTTURA
•
RISALDA LA ROTTURA E SI DISSOCIA
DAL DNA
Processi vitali quali la replicazione, la trascrizione, la ricombinazione,
portano il DNA a superavvolgersi.
Se da un lato un eccesso di superavvolgimento è deleterio per la
cellula, entro certi limiti esso favorisce lo svolgersi di alcuni processi,
come l'inizio della trascrizione.
Le DNA topoisomerasi svolgono il ruolo fondamentale di controllo
sullo stato topologico del DNA consentendone il mantenimento della
funzionalità.
Come possiamo valutare Topoisomersi IIα:
• Si può determinare l’epressione della proteina mediante reazione
immunoistochimica.
La proteina topoisomersi IIα è di 170kDa, nucleare e rilevabile
mediante anticorpo monoclonale specifico.
• Si può valutare lo status del gene, che è localizzato sul cromosoma
17q21, mediante tecnica FISH e CISH
Nel nostro laboratorio valutiamo lo
status dei geni Topoisomersi IIα
ed HER-2 con tecnica FISH.
Di recente abbiamo provato la CISH
con ottimi risultati.
Casi valutati in doppio,
stesso score.
Tecnica FISH
(fluorescence in situ hybridization)
•Sparffinatura
•Pretrattamento
Termico ed enzimatico
•Codenaturazione
•Incubazione o.n
•Lavaggio di stringenza
•Contrasto DAPI
•Coprioggetto
•Lettura.
Lo status del gene:
• Normale
• Amplificato
• Deleto
Amplificazione
CEP17
TOP2α
Non amplificazione
Amplificazione Top2α :
FISH
CISH
FISH Topoisomerasi IIa
Amplificazione
Delezione
Interpretazione dei risultati per determinare lo
status di
TOP2α
–
–
–
Se ratio > 2.0: Amplificato
Se ratio compresa tra 0,8 < 2.0: Normale
Se ratio < 0.8: Deleto
ma non è sempre così semplice…
PROBLEMI!
Casi di difficile interpretazione:
Cause preanalitiche, analitiche e di
interpretazione dei preparati
Colonne d’Ercole
Perché valutare Topoisomerasi IIα ?
• Topoisomersi IIα è il target molecolare dell’azione
farmacologica delle antracicline. Epirubicina e doxorubixcina
sono le antracicline che vengono usate più comunemente come
chemioterapici. Si sono dimostrate efficaci in diversi tipi di
tumore tra cui il carcinoma mammario dove sono utilizzate sia
in terapia adiuvante che nella malattia metastatica.
Schemi terapeutici più utilizzati
CMF (ciclofosfamide, metotrexate e fluorouracile)
– FAC (fluorouracile, doxorubicina e ciclofosfamide)
– FEC o CEF (fluorouracile, epirubicina e
ciclofosfamide)
– AC (doxorubicina e ciclofosfamide).
-
Antracicline e TopoII A
Le antracicline sono farmaci antitumorali appartenenti alla
categoria degli antibiotici citotossici, ovvero un gruppo di
farmaci, isolati per lo più da fonti naturali, la cui azione
antineoplastica è dovuta ad interazione con il DNA, con
conseguente introduzione di danni all’acido nucleico che
innescano l’apoptosi. Le antracicline sono molto efficaci ma
anche molto tossiche dal momento che non discriminano
tra le cellule tumorali e le cellule sane.
Meccanismo di azione delle Antracicline
Antracicline
.
Le antracicline, sono in grado di formare un complesso ternario
con il DNA e la topoisomerasi (stabilizzando quindi il cosiddetto
“cleavable complex”).
Le antracicline sono in grado di ostacolare una fase specifica
del processo catalitico che consiste nella rigiunzione del DNA
precedentemente tagliato.
Per la terapia adiuvante del carcinoma della
mammella, dati clinici hanno dimostrarto che
regimi chemioterapici che includano
antracicline, mostrano un incremento di
sopravvivenza significativa rispetto ai regimi
che non contengono antracicline.
Danish Breast Cancer Group
trial 89D
• Lo studio DBCG (Danish Breast Cancer Cooperative Group)
89D ha avuto come obiettivo primario la valutazione di
alterazioni genetiche (amplificazione e delezione) del gene
Topoisomerasi IIα. Lo studio si prefiggeva di valutare se
TopoisomerasiIIα potesse essere considerato come un marker
predittivo in pazienti con carcinoma mammario
precedentemente sottoposte a trattamento con antracicline.
Come obiettivo secondario, lo studio ha valutato le proprietà
prognostiche di Topoisomerasi IIα e le correlazioni con HER-2.
Danish Breast Cancer Group 89D
• Il DBCG 89D è uno studio randomizzato, aperto e
prospettico.
• Dopo il trattamento chirurgico 980 donne, sia in fase
pre- che post-menopausale, portatrici di carcinoma
infiltrante della mammella, sono state randomizzate
per CMF o CEF.
Risultati del DBCG 89D
TOP2A status
%
Deleto
11.3%
Normale
76.8%
Amplificato
11.9%
Totale
100%
Risultati del DBCG 89D
Lo studio ha valutato:
• la sopravvivenza libera da malattia (recurrence free
survival, RFS)
• la sopravvivenza globale (overall survival, OS)
RFS per CMF e CEF in pazienti con TOP2A
amplificato
RFS per CMF e CEF in pazienti con TOP2A
normale
RFS e status di TOP2A
Le alterazioni genetiche di TOP2A sono un fattore prognostico negativo
INDIPENDENTE
OS e status di TOP2A
Le alterazioni genetiche di TOP2A sono un fattore prognostico negativo
INDIPENDENTE
Alla luce di questi dati:
• Stiamo valutando Topoisomerasi IIα su pazienti affette
da carcinoma mammario che afferiscono presso la
nostra struttura.
• Stiamo valutando Topoisomarsi IIα in pazienti in follow
up.
• Stiamo sperimentando un modello in vitro.
Amplificazione genica = migliore risposta alle
antracicline? Modello in vitro
FISH per HER2 e Topoisomerasi IIa su linee cellulari HER-2+
Presenza di amplificazione HER2
Presenza di amplificazione HER2
Presenza di amplificazione Topoisomerasi IIa
Assenza di amplificazione Topoisomerasi IIa
Somministrazione adriamicina
Apoptosi
Fine
Somministrazione adriamicina
Arresto della crescita cellulare
Crescita cellulare
FISH popolazione sopravvissuta
Ricrescita
FISH
FISH
Linee guida St Gallen 2007
Chemioterapia del carcinoma mammario
Chemioterapia neoadiuvante
• Il trattamento chemioterapico prevede generalmente l’utilizzo delle antracicline,
da sole o in associazione, per 4-6 cicli.
• L’aggiunta dei taxani aumenta le risposte cliniche (75 versus 95%, fino ai due
terzi delle quali complete) e patologiche (3-20 versus 30-35%).
Effetti collaterali delle antracicline
•
•
•
•
•
•
•
Mielosoppressione
Cardiotossicita‘
Reazioni di necrosi cutanea da stravaso
Mucosite (stomatite, faringite),
Alopecia
Congiuntivite
Eruzioni cutanee.
• Cardiotossicità
Per la dose totale di antracicline è opportuno tenere presente nel
singolo paziente le eventuali terapie concomitanti con altri
farmaci potenzialmente cardiotossici, quali ad es. ciclofosfamide e
daunorubicina.
Lo scompenso cardiaco può comparire anche alcune settimane
dopo la fine del trattamento con Adriblastina.
• Cardiotossicità ritardata
La cardiotossicità “ritardata” può sivilupparsi nel corso della
terapia o nei 2-3 mesi successivi alla terapia (sono tuttavia
riportati casi in cui si è mainfestata molti mesi o addirittura anni
dopo la sospensione del farmaco).
Alcuni dati…
• Pazienti sottoposte a chemioterapia con antracicline
• A 5 anni: prevalenza di cardiopatia del 15%
• A 10 anni prevalenza di cardiopatia del 39%
ASCO 2006, Giordano et al
• La mortalità stimata di tutti i casi di tossicità cardiaca
da antracicline è intorno al 20%
(Tokarska-Schlattner et al,
2006)
• La mortalità ad un anno dei pazienti con scompenso di
classe IV (secondo NYHA) è circa del 50% mentre nella
classe III è del 20-25%
(Elliott, 2006).
In conclusione…
La cardiopatia è degli effetti collaterali indotti dalle
antracicline e rappresenta il limite
dose-dipendente della tossicità del farmaco data la
prognosi poco favorevole
Trastuzumab…effetti collaterali
• Cardiotossicità
E’ stata osservata insufficienza cardiaca (classe II-IV secondo
la New York Heart Association [NYHA]) nei pazienti trattati
con Herceptin in monoterapia o in terapia di associazione a
paclitaxel, in particolare dopo chemioterapia con antraciclina
(doxorubicina o epirubicina). Questa può essere da moderata
a grave ed è stata associata a decesso
Antracicline e Trastuzumab
• L'uso concomitante di trastuzumab con antracicline è associato a
cardiotossicità.
• Poiché l’emivita di Herceptin è di circa 28,5 giorni (intervallo di
confidenza 95%, 25,5 - 32,8 giorni), Herceptin può persistere nel
sistema circolatorio fino a 24 settimane dopo la fine del trattamento.
• I pazienti che ricevono antracicline dopo la fine del trattamento con
Herceptin sono a maggior rischio di cardiotossicità.
Da questi dati emerge…
• L’importanza di una corretta valutazione dello status di
Topoisomerasi2α e di HER-2
• L’impatto che il nostro lavoro, in laboratorio
ed al microscopio, ha sulla vita di queste pazienti.
In questo caso la parola vita significa:
•qualità di vita, che migliora evitando inutili ed inefficaci terapie
dettate da una non corretta determinazione dello status dei geni sopra
citati.
•Sopravvivenza, che migliora se il trattamento
chemioterapico è appropriato.
Oggi nel nostro laboratorio possiamo indagare Riusciamo a
l’invisibile…l’amplificazione o la delezione di un gene, l’iperespressione di una proteina… Possiamo farlo e dobbiamo farlo bene perché il nostro scrutare in questa sorta di “sfera di cristallo” si traduce in vantaggi reali sul futuro delle persone
C. Lupo
Bello è ciò che vediamo,
più bello ciò che conosciamo,
ma di gran lunga più bello
è ciò che ancora ignoriamo.
Niels Stensen
Grazie per l’attenzione