UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “LA SAPIENZA”
Istituto di Farmacologia, Dipartimento di Fisiologia e Farmacologia Vittorio Erspamer
Dottorato di Ricerca in Farmacologia
Ciclo XXIII
“RUOLO DELLE PROCHINETICINE, DEI LORO RECETTORI E
DELL’ANTAGONISTA PC1 NELLE CANCER STEM CELLS DI GLIOBLASTOMA: STUDI
IN VITRO E MODELLI IN VIVO”
COORDINATORE: Prof.ssa Lucia Negri
DOTTORANDO: Dott.ssa Maria Laura Evangelista
INDICE:
Abstract…………………………………………………………….pag. 3
Razionale…………………………………………….....................pag. 4
Obiettivi……………………………………………………………pag. 8
Materiali e metodi …………………………………………………pag. 8
Risultati…………………………………………………………….pag. 12
Conclusioni…………………………………………………………pag. 23
Bibliografia………………………………………………………….pag. 26
Abstract
Bv8/prochineticine (PK2) appartengono a una nuova famiglia di chemochine coinvolte nella
modulazione della soglia del dolore in condizioni normali o patologiche, nella ematopoiesi e nella
angiogenesi. Bv8/PK sono altamente espresse nei leucociti mentre i recettori PKR, oltre ad essere
presenti sulle cellule ematiche, sono espressi nei nocicettori primari dei gangli delle radici dorsali.
Evidenze sperimentali dimostrano che le proteine BV8/PK liberate nel tessuto infiammato agiscono
come regolatori autocrini/paracrini delle risposte immuno-infiammatorie, stimolano i recettori PKR
neuronali e determinano un aumento della responsività dei nocicettori. Date queste premesse
Bv8/PKs rappresentano candidati estremamente interessanti come mediatori della angiogenesi
dipendente da cellule infiammatorie e del dolore associato alla patologia tumorale.
Dal momento che Bv8/PKs sono over-espresse in alcuni tipi di tumore solido e in cellule tumorali
della linea mieloide, ci proponiamo di studiare se l’utilizzo dell’antagonista del recettore PK-R1 di
natura non peptidica,PC-1, poichè già anticorpi neutralizzanti anti PK2 hanno mostrato in studi
precedenti un’attività antitumorale, possa avere un ruolo inibitorio, in vivo ed in vitro, sulla crescita
e differenziazione delle cellule tumorali ed in particolare su cellule tumorali staminali di
glioblastoma.
I risultati ottenuti dimostrano “in vivo” l’attività antitumorale dell’antagonista PC-1 attraverso la
diminuzione dei diametri dei noduli tumorali nei modelli di xenotrapianti ,della densità della
vascolarizzazione e l’aumento delle aree di necrosi nella massa neoplastica ed “in vitro” una
diminuzione dei livelli intracellulari di ATP.
Questa molecola inoltre, potrebbe essere ulteriormente ed in modo promettente sviluppata, in regimi
di combinazione terapeutica con farmaci chemioterapici tradizionali e/o con inibitori
dell’angiogenesi attraverso la via del VEGF.
Razionale
Bv8/prochineticine (PK1 e PK2) appartengono ad una nuova famiglia di chemochine, caratterizzate
dalla presenza di cinque ponti disolfuro, e legano a due recettori a G proteine, PKR1 e PKR2, tra
loro altamente correlati. A questi peptidi sono state riconosciute una serie di funzioni incluso il
ruolo nella modulazione della soglia nocicettiva in condizioni normali o patologiche, nella
angiogenesi e nel cancro . Gli elevati livelli di espressione di Bv8/PK2 nel midollo osseo, negli
organi linfoidi e nei leucociti ha suggerito il coinvolgimento di questi peptidi nella ematopoiesi e
nei processi infiammatori. Sia nei roditori che nell’uomo il trascritto primario di PK2 risulta
fortemente up-regolato nel tessuto infiammatorio.
I recettori delle prochineticine, altamente espressi nei gangli delle radici dorsali e nel midollo
spinale, esercitano una attivazione tonica del recettore canale TRPV1, un canale ionico eccitatorio
critico nella percezione del dolore. Bv8/PK sono in grado di indurre chemiotassi ed il rilascio di
citochine infiammatorie e pronocicettive agendo sui recettori PKR presenti sui monociti, macrofagi
e cellule dendritiche .
Questi dati supportano un modello in cui Bv8/PKs rilasciate nel tessuto danneggiato agiscono come
un modulatore autocrino/paracrino della risposta immuno-infiammatoria e sono in grado di
stimolare i recettori PKRs neuronali aumentando la responsività dei nocicettori.
Inoltre Bv8/PKs inducono fenomeni di angiogenesi tessuto specifica.
Infatti, sebbene da un punto di vista tradizionale si sia fino ad ora ritenuto che la principale fonte di
fattori angiogenici fossero le cellule tumorali, è ormai evidente che le cellule non maligne che
infiltrano il tumore, come le cellule mieloidi, possano svolgere un ruolo nella angiogenesi tumorale,
anche se il meccanismo molecolare di tale effetto rimane ancora da chiarire. Ferrara ha dimostrato
che nel topo: i) l’impianto di cellule tumorali determina una up-regolazione di Bv8/PK2 nelle
cellule mieloidi; ii) il G-CSF è il principale responsabile della modulazione della espressione di
Bv8/PK2; iii) la iniezione di G-CSF aumenta i livelli della proteina Bv8/PK2 nel midollo osseo e
nel siero; iv) la introduzione mediante adenovirus di Bv8/PK2 nel tumore promuove angiogenesi; v)
anticorpi anti-Bv8/PK2 inibiscono la crescita di diversi tipi di tumori, sopprimono la angiogenesi e
riducono la mobilizzazione di cellule mieloidi. Quindi Bv8/PK2 modula la mobilizzazione dei
neutrofili dal midollo osseo durante la progressione tumorale, promuove la angiogenesi a livello
locale e potrebbe essere responsabile dell’abbassamento della soglia nocicettiva. Complessivamente
questi dati suggeriscono che Bv8/PK2 rappresenta un candidato estremamente interessante come
mediatore della angiogenesi dipendente da cellule infiammatorie e del dolore associato alla
patologia tumorale.
Bv8/PK2 è fortemente espressa in cellule tumorali umane della linea mieloide (es. HL-60) e
Bv8/PKs sono over-espresse in alcuni tessuti tumorali umani come quello del testicolo, del colon,
della prostata, dell’ovaio e nel neuroblastoma infantile, suggerendo un ruolo importante ma ancora
inesplorato per il sistema Bv8/PK-PKR nello sviluppo e progressione tumorale. Fino ad oggi non ci
sono dati disponibili concernenti la espressione di Bv8/PKs nei leucociti circolanti di pazienti affetti
da tumore solido o linfopoietico.
L’antagonista dei recettori delle prochineticine, PC1, di natura non peptidica, ha dimostrato in studi
in vivo una potente azione inibitoria dei molti processi attivati dal legame di Bv8 con il recettore
PKR1, in particolare di quelli iperalgesici, di quelli infiammatori e di quelli proangiogenetici.
Tra le neoplasie umane in cui i fenomeni di angiogenesi sembrano rivestire un ruolo di primaria
importanza c’è sicuramente il glioblastoma.
Il glioblastoma (noto anche come glioblastoma multiforme) è il tumore più comune ed agressivo tra
le neoplasie della glia e, nonostante i recenti progressi nel trattamento, la prognosi per i pazienti
affetti da questo tipo di neoplasia rimane infausta.
Il glioblastoma può svilupparsi da un astrocitoma diffuso (grado II) o da un astrocitoma anaplastico
(grado III) in tal caso è detto secondario, ma più frequentemente si manifesta de novo, senza alcuna
evidenza di precedente neoplasia ed è allora definito come primario.
Da un punto di vista epidemiologico colpisce soprattutto, ma non solo, gli adulti.
Si presenta solitamente negli emisferi cerebrali; meno frequentemente si localizza al tronco
cerebrale o al midollo spinale.
Come tutti i tumori cerebrali, salvo rarissimi casi, non si espande oltre le strutture del sistema
nervoso centrale.
Il trattamento del glioblastoma include chirurgia, radioterapia e chemioterapia. Rari ma non nulli i
casi di lunga sopravvivenza.
Composto da una popolazione eterogenea di cellule tumorali astrocitiche scarsamente differenziate,
la sua crescita viene controllata da alcune cellule staminali presenti nel tessuto cerebrale.
A partire dagli anni novanta studi prima sugli animali e poi sull’uomo hanno mostrato che
all’interno del sistema nervoso centrale, in particolare nel giro dentato dell’ippocampo e nella zona
subventricolare dei ventricoli laterali, ha luogo un continuo rinnovamento cellulare con formazione
di cellule staminali neuronali multipotenti, in grado cioè di produrre nuove cellule indifferenziate
(staminali) e cellule mature, quali neuroni, astrociti ed oligodendrociti.
Tali cellule sono quindi in grado di auto-rinnovarsi provvedendo al mantenimento costante del
numero cellulare.
A partire dal 2002 circa, si è dimostrato che nei tumori cerebrali, in particolare nei glioblastomi,
esiste una gerarchia di cellule tumorali.
Una parte del tumore, percentualmente più esigua, risulta quindi rappresentata da cellule che hanno
le stesse caratteristiche delle staminali neuronali e che sono comunemente indicate con il nome di
cellule staminali neoplastiche cerebrali (brain tumor stem cells).
Sono queste la fonte di rinnovamento del tumore poiché riproducono continuamente tanto cellule
staminali tumorali quanto cellule tumorali differenziate.
Mentre queste ultime rappresentano la quota sensibile ai trattamenti terapeutici attualmente in uso,
le cellule staminali neoplastiche sono di fatto refrattarie a radioterapia e chemioterapia poiché in
possesso di sistemi di riparazione cellulare più attivi e precoci.
Le cancer stem cells potrebbero quindi avere un ruolo nel fallimento delle terapie e nello sviluppo
delle recidive del glioblastoma.
Come già detto, la loro potenziale resistenza alla chemioradioterapia classica, ha aperto la ricerca
all’individuazione di nuovi approcci terapeutici che, in relazione all’elevata vascolarizzazione e
neoangiogenesi di queste neoplasie, si sono orientati nei farmaci ad azione antiangiogenetica.
L’anticorpo monoclonale umano anti VEGF (bevacizumab), già da alcuni anni utilizzato in
combinazione con farmaci chemioterapici tradizionali nel trattamento di diversi tumori solidi ,ha
ottenuto in tempi più recenti l’approvazione da parte delle autorità regolatorie per il trattamento del
glioblastoma.
Obiettivi
Poichè Bv8/PKs risultano over-espressi sia in alcuni tipi di tumori solidi umani che in cellule
tumorali umane della linea mieloide, questo progetto di ricerca, svolto in collaborazione con il
Dipartimento di Oncologia e Medicina Molecolare dell’Istituto Superiore di Sanità e con il
Dipartimento di Neurochirurgia dell’ Università Cattolica di Roma, si è posto l’obiettivo di
individuare, attraverso l’utilizzo dell’antagonista non peptidico dei recettori delle PKs, PC-1, se
l’angiogenesi mediata da fattori diversi dal VEGF, nello speecifico mediata dalle prochineticine e
dai loro recettori, possa avere un ruolo nella proliferazione e differenziazione delle cellule tumorali
staminali di glioblastoma.
Materiali e metodi.
Selezione delle linee cellulari.
In una fase preliminare dello studio sono state selezionate 26 linee di cellule staminali di
glioblastoma in coltura, isolate da frammenti tumorali umani prelevati in corso di intervento
neurochirurgico.
Queste sono quindi state sottoposte ad estrazione dell’m-RNA per valutare con tecnica real Time
quantitative PCR il profilo di espressione genica di BV8/PKs e del recettore PK-R1
Successivamente, dalle 26 iniziali, sono state selezionate due linee cellulari: BTSC#1 (clone
negativo per espressione genica di PK-R1) e BTSC#83 (clone positivo per espressione genica di
PK-R1).
Studi “in vivo”
Sedici topo nudi atimici, del peso medio di circa 30 gr, sono stati divisi in due gruppi; nel gruppo
dei primi otto sono stati realizzati xenotrapianti attraverso inoculi sottocutanei di BTSC#83 (il
numero medio di cellule inoculate era di 5x104); nel secondo gruppo la medesima procedura
avveniva con inoculi sottocutanei di BTSC#1.
In ogni gruppo veniva individuato un braccio di trattamento ed un braccio di controllo.
Gli animali nel braccio di trattamento, tanto nel gruppo degli xenotrapianti con BTSC#83 che con
BTSC#1, ricevevano somministrazioni intraperitoneali (IP), ciascuna del volume di 100 microlitri,
di soluzione contenente PC-1 alla concentrazione di 0.09 mcg/mcL per una dose di 600 mcg/kg
totali/die, ma divisa in due somministrazioni di 300 mcg/kg giornaliere, per 5 giorni consecutivi;
Il trattamento veniva ripetuto dopo 4 settimane.
Il braccio di controllo riceveva, con la medesima schedula, la somministrazione IP di soluzione di
cloruro di sodio allo 0,9%.
Allo scopo di osservare gli effetti di un trattamento con PC-1 eseguito per via sistemica e per
meglio valutare il grado di angiogenesi, si è atteso che i noduli sottocutanei degli xenotrapianti
raggiungessero un diametro ≥ di 1 cm.
Seguendo lo schema usato in altri lavori svolti nel nostro laboratorio è stato programmato di
sacrificare per ogni gruppo e per ogni braccio un primo animale dopo una settimana dal termine del
trattamento per cercare eventuali fenomeni degenerativi acuti a carico dei vasi ed un secondo
animale dopo quattro settimane (quindi dopo il secondo ciclo di trattamento) per valutare eventuali
variazioni nella densità vascolare.
Valutazioni di immunoistochimica.
Dagli xenotrapianti, secondo le tempistiche sopra riportate, sono state allestite sezioni di tessuto
neoplastico, fissate in formalina, incluse in paraffina e quindi sottoposte ad immunoistochimica per
la valutazione del grado di necrosi, della densità vascolare e della degenerazione mixoide
eventualmente indotta dal trattamento attraverso le tre seguenti colorazioni:
-ematossilina ed eosina (rispettivamente per lo studio delle componenti basofile a prevalente
localizzazione nucleare verso quelle acidofile a prevalente localizzazione citoplasmatica,
extracellulare e fibrotica).
- Ab monoclonale murino anti GFAP (proteina acida fibrillare gliale, marker di identificazione
dell’origine astrocitaria della cellula)
- Ab policlonale, con origine da coniglio, anti Fattore VIII ( o anti vWf – von Willebrand Factor,
marker di origine endoteliale/vascolare della cellula)
Studi “in vitro”
La terza ed ultima parte dell’esperimento, quella “in vitro”, è stata condotta attraverso l’utilizzo di
concentrazioni crescenti (0,3, 3 e 30 micromolare) di PC-1 su colture di linee cellulari di
glioblastoma, sempre sia su BTSC#83 che BTSC#1, per valutare, attraverso la misurazione dei
livelli intracellulari di ATP (nucleotide la cui sintesi è scelta come indice di vitalità/produzione
energetica cellulare), la citotossicità dell’antagonista di PK-R1.
La misurazione delle concentrazioni intracellulari di ATP era effettuata con il sistema
bioluminescente luciferina-luciferasi (secondo la relazione per cui, per ogni molecola di nucleotide
rilasciata, viene emesso un fotone di luce che viene captato da un luminometro),.
PC1 veniva aggiunto sia 24h dopo la piastratura che 10 giorni dopo la piastratura, cioè dopo aver
fatto differenziare le cellule (le BTSCs differenziano in senso prevalentemente gliale dopo 10-15 gg
in coltura con terreno staminale senza siero+matrigel) in due diversi terreni di coltura.
Il primo di questi era rappresentato da terreno staminale senza siero fetale bovino (FBS), al fine di
evitare possibili contaminazioni di origine animale causa di immunogenicità, addizionato a
matrigel, cioè un estratto di lamina basale del sarcoma murino di Engelbreth-Holm-Swarm, ricco in
proteine della matrice extracellulare, quali la laminina, il collagene IV, l’entactina, gli HSGP
(heparan sulfate proteoglycan) ed alcuni fattori di crescita come TGF-2, FGF-2, IGF-1 e IGF-2; la
scelta di questo tipo di terreno avveniva per osservare il comportamento delle linee cellulari in
condizioni ”basali”
Il secondo era rappresentato dallo stesso matrigel ma addizionato a terreno HUVEC (Human
Umbilical Vein Endothelial Cells), cioè rispetto al precedente, più ricco di fattori di crescita
proangiogenetici quali l’aFGF, bFGF ed EGF 1; la selezione di questo tipo di terreno avveniva
invece per valutare il comportamento delle linee cellulari in un ambiente che favorisse il
differenziamento delle staminali stesse verso un fenotipo endoteliale piuttosto che gliale.
Il braccio di controllo era rappresentato dalle due medesime linee cellulari in coltura nei suddetti
terreni e senza l’aggiunta di antagonista di PK-R1
La misura dei livelli di ATP intracellulari veniva quindi eseguita dopo 48h, 72h e 7gg dall’aggiunta
del PC-1 nelle due diverse condizioni sperimentali.
Risultati
Sono state selezionate dalla banca delle cellule staminali di glioblastoma depositate presso l’Istituto
Superiore di Sanità, 26 linee cellulari tumorali staminali di glioblastoma
Dopo isolamento di RNA e real time RT-PCR quantitativa, in nessuna di queste è stata individuata
l’espressione di Bv8, mentre nelle linee 28, 67, 70, 76, 83, 83.2, 120, 151, 169 si è evidenziata
l’espressione del recettore PKR1.
Tutti gli animali xenotrapiantati con le linee prescelte (BTSC#83 e BTSC#1 hanno eseguito le
somministrazioni previste di PC-1 e tollerato bene il farmaco senza mostrare alcun evento avverso.
Risultati negli xenotrapianti con BTSC#83
Sui noduli sottocutanei, alla 24° e 48° ora successive al trattamento, non si assisteva ad alcun effetto
di riduzione dei diametri dei noduli tumorali, come anche al termine dei 5 giorni di inoculo
A distanza invece di una settimana dall'ultimo giorno di inoculo si osservava una riduzione
significativa di diametro nel braccio dei trattati.
In particolare un nodulo ”target” era passato da 12 mm a 6 mm di diametro.
I primi dati sull’istologia avevano subito evidenziato un quadro molto alterato rispetto al controllo,
in particolare:
1. mentre nei controlli le cellule tumorali formavano strutture epitelioidi compatte, nel topo trattato
queste apparivano organizzarsi in un tessuto tipo pseudo-mixoide, cioè con cellule tumorali più
rarefatte e inframezzate da matrice intercellulare amorfa;
2. nel trattato inoltre erano presenti importanti fenomeni infiammatori caratterizzati da un infiltrato
di cellule mononucleate (monociti e macrofagi) e un accumulo di fibroblasti, che non si
verificavano nel controllo.
I dati ottenuti a distanza di 4 settimane dalla fine del trattamento confermavano i fenomeni già visti
ad una settimana dalla fine della terapia ma con alcune variazioni, e cioè:
- i fenomeni di flogosi acuta erano attenuati considerevolmente, si riduceva cioè sia l’infiltrato di
cellule mononucleate che l’accumulo di fibroblasti;
- persistevano vaste aree con cellule di morfologia allungata ed aspetto sofferente circondate da una
matrice intercellulare amorfa, anch'essa probabile espressione di sofferenza cellulare;
- comparivano però nidi di cellule tumorali floride che iniziavano a colonizzare le aree precedenti.
Complessivamente il quadro istologico e microscopico correlava perciò con quanto osservato
macroscopicamente, cioè una riduzione del diametro del tumore nel corso della prima settimana
dopo il trattamento, una sostanziale stazionarietà per due settimane e una ripresa della crescita alla
quarta settimana.
Dal punto di vista macroscopico, dopo il primo ciclo di trattamento, la riduzione del diametro dei
noduli tumorali si protraeva sino a 3 settimane; si assisteva quindi ad una ricrescita degli stessi tra
la 3^ e la 4^ settimana, allorchè veniva intrapreso il secondo ciclo.
A seguito dei questo,inaspettatamente, si verificava dapprima un aumento del diametro, durante il
trattamento, seguito poi da una graduale riduzione fino a valori leggermente inferiori al diametro
iniziale.
Infine, dopo questo 2° ciclo non si verificava la ricrescita a 3-4 settimane che si era osservata dopo
il 1° ciclo ma si assisteva ad una tendenza del tumore a stabilizzarsi nelle dimensioni come per
raggiungimento di un “plateau”;
Risultati negli xenotrapianti con BTSC#1
Gli xenotrapianti con BTSC#1 già al primo ciclo di trattamento mostravano un aumento del
diametro come reazione acuta alla somministrazione. In seguito csi verificava una riduzione delle
dimensioni ma la ricrescita era più precoce, ossia tra la 2^ e la 3^ settimana.
Anche dopo il secondo ciclo di trattamento non si osservava alcuna riduzione dei diametri dei
noduli tumorali.
Per quanto concerneva il quadro istologico del BTSC#1 ad una settimana dopo il trattamento, anche
in questo caso si osservava un sovvertimento della citoarchitettura del tumore con la presenza di
una reazione fibrotica importante che circondava i noduli delle cellule tumorali presenti sia in
apoptosi che in fase florida. Rispetto al BTSC#83 mancava invece la componente mixoide.
Il quadro si mostrava stabile anche dopo 4 settimane dal trattamento.
Sono di seguito riportate in forma grafica le variazioni dimensionali dei grafts e le immagini
relative ai preparati istologici.
Schema di trattamento ed effetto di PC-1 sul diametro tumorale nei topi trattati rispetto al
braccio di controllo
( xenotrapianti con BTSC#83, linee cellulari risultate positive in PCR per il recettore PK-R1)
Preparati istologici ottenuti, ad una e quattro settimane dal termine del trattamento, da
xenotrapianti di topi trattati con PC-1 rispetto al braccio di controllo
( xenotrapianti con BTSC#83, linee cellulari risultate positive in PCR per il recettore PK-R1)
Colorazioni eseguite:
-ematossilina/eosina
-Ab antiGFAP (proteina fibrillare acida della glia) per l’identificazione dei filamenti
intermedi di tipo III degli astrociti.
- Ab antiFVIII, marker di vascolarizzazione per la microvessel density, marcatore endoteliale,
colorazione utilizzata per determinare il fenomeno di angiogenesi come indicatore di
ricorrenza tumorale
Effetto di PC-1 sul diametro tumorale nei topi trattati rispetto al braccio di controllo.
( xenotrapianti con BTSC#1, linee cellulari risultate negative in PCR per il recettore PK-R1)
Preparati istologici ottenuti ad una e quattro settimane dal termine del trattamento, da
xenotrapianti di topi trattati con PC-1 rispetto al braccio di controllo
( xenotrapianti con BTSC#1, linee cellulari risultate negative in PCR per il recettore PK-R1)
Colorazioni eseguite:
-ematossilina/eosina
-Ab antiGFAP (proteina fibrillare acida della glia) per l’identificazione dei filamenti
intermedi di tipo III degli astrociti.
Risultati degli studi “in vitro”
Nella prima condizione sperimentale, cioè in terreno staminale senza siero + matrigel, quando alle
BTSC#1 veniva aggiunto PC-1, mediamente si osservava un aumento dei livelli di ATP rispetto alle
stesse cellule non trattate (ciò specie alle dosi di 0,3 e 3 micromolare) mentre nelle BTSC#83 si
osservava una costante riduzione dei livelli di ATP rispetto alle cellule non trattate e ciò avveniva
sia a 24 h che a 10 gg dalla piastratura.
Nella seconda condizione sperimentale, cioè in terreno HUVEC (Human Umbilical Vein
Endothelial Cells) + matrigel, quando alle BTSC#1 veniva aggiunto PC-1, mediamente non si
osservava una riduzione significativa dei livelli di ATP rispetto alle stesse cellule non trattate
mentre nelle BTSC#83 si osservava una costante riduzione degli stessi, sia a 24 h che a 10 gg dalla
piastratura, molto evidente specie con l’utilizzo della dose di 30 micromolare e dopo 7 giorni dal
trattamento.
BTSC#1+PC1 dopo 24h dalla piastratura
Matrigel+NSC
BTSC#1+PC1 dopo 10gg dalla piastratura
Matrigel+NSC
Asse X = concentrazioni micromolari di PC-1
Asse Y = concentrazione di ATP in micromoli
BTSC#83+PC1 dopo 24h dalla piastratura
Matrigel+NSC
BTSC#83+PC1 dopo 10gg dalla piastratura
Matrigel+NSC
Asse X = concentrazioni micromolari di PC-1
Asse Y = concentrazione di ATP in micromoli
BTSC#1+PC1 dopo 24h dalla piastratura
Matrigel+HUVEC medium
BTSC#1+PC1 dopo 10gg dalla piastratura
Matrigel+HUVEC medium
Asse X = concentrazioni micromolari di PC-1
Asse Y = concentrazione di ATP in micromoli
BTSC#83+PC1 dopo 24h dalla piastratura
Matrigel+HUVEC medium
BTSC#83+PC1 dopo 10gg dalla piastratura
Matrigel+HUVEC medium
Asse X = concentrazioni micromolari di PC-1
Asse Y = concentrazione di ATP in micromoli
Conclusioni
La tumorigenesi è un processo complesso che coinvolge non solo le cellule tumorali attivamente
proliferanti. Le cellule tumorali infatti sono circondate da un microambiente stromale di cellule
eterogenee come i fibroblasti, le cellule endoteliali e quelle del sistema immune. Queste cellule
rispondono ai segnali inviati dalle cellule tumorali proliferanti attraverso il rilascio di fattori
secretivi che perpetuano la crescita ed il rimodellamento della matrice, contribuiscono
all’angiogenesi e modulano e reindirizzano il ruolo delle cellule immunitarie. Ormai da lungo
tempo si è compreso come l’angiogenesi sia una parte importante della tumorigenesi e numerosi
sono stati gli studi ed i tentativi per bloccare questo processo. Sono infatti stati identificati numerosi
ed importanti fattori angiogenetici come il VEGF ed agenti terapeutici volti a bloccare questa via di
trasmissione del segnale, tuttavia non universalmente attivi ed efficaci. Molte neoplasie infatti sono
resistenti alle terapie anti VEGF o diventano refrattarie a queste nel corso del trattamento, fatto
evidenziato dallo sviluppo di recidive dal comportamento spesso più aggressivo rispetto a quello
del tumore primitivo. C’è quindi necessità di individuare nuovi target e vie di segnale che possano
contribuire all’angiogenesi o ad altri processi coinvolti nella progressione tumorale, come
l’infiltrazione macrofagica. Bv8/PKs e i suoi recettori sono parte della via di segnale coinvolta nella
mobilizzazione delle cellule mieloidi. Molti studi hanno dimostrato che precursori di cellule
mieloidi (CD11b+Gr1+) possono contribuire all’angiogenesi e alla tumorigenesi in differenti tipi di
neoplasie. I macrofagi, che derivano da queste cellule progenitrici, secernono nel microambiente
tumorale diverse citochine che influenzano direttamente la crescita tumorale. Studi più recenti
hanno comparato l’efficacia antitumorale di trattamenti con anticorpi anti Bv8/PKs con quelli anti
VEGF dimostrandone la pari attività nel prevenire la progressione di malattia in modelli tumorali di
topi transgenici, mentre la combinazione dei due tipi di anticorpi ha mostrato un effetto di
potenziamento nell’inibizione della crescita sottocutanea di diverse linee cellulari di neoplasie
umane e murine.
I trattamenti con anticorpi anti Bv8/PKs hanno inoltre dimostrato di ridurre il numero di cellule
mieloidi (CD11b+Gr1+) sia circolanti che infiltranti il microambiente tumorale, compresi i
macrofagi derivati dal midollo osseo, cellule che sono state precedentemente individuate come
mediatrici della refrattarietà alle terapie con anticorpi anti VEGF in diversi modelli di xenotrapianti
tumorali murini.
Benchè preliminari e di “tipo pilota” i risultati degli esperimenti sopra riportati hanno dimostrato
che:
- in vivo, ma solo in presenza del recettore PK-R1, PC-1 è in grado di ridurre nelle dimensioni i
noduli tumorali degli xenotrapianti e di indurre una loro degenerazione a livello istologico in senso
mixoide con riduzione della densità delle cellule tumorali e dei neovasi;
-in vitro, indipendentemente dal mezzo di coltura utilizzato, PC-1 è in grado di indurre una
riduzione della vitalità cellulare misurata sui livelli di ATP intracellulare, e che quindi possa
svolgere un potenziale effetto citostatico, citotossico e antireplicativo, ma solo nelle linee cellulari
di glioblastoma che esprimono il recettore PK-R1 .
I futuri passi terapeutici nel campo di tale patologia oncologica non dovrebbero quindi poter
prescindere dalla valutazione di questi nuovi “target” e dei loro antagonisti, sia come singoli agenti
terapeutici
che in
combinazione con “regimi
chemioterapici tradizionali” o inibitori
dell’angiogenesi mediata dal VEGF (doppia inibizione angiogenetica), ciò al fine di sortire un
effetto sinergico sul controllo della crescita tumorale.
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