Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
Capitolo 1
Specie chimiche reattive e radicali liberi
A cura di Eugenio Luigi Iorio
gativo (–7) al più positivo (+7), zero compreso,
l’ossidazione, coincidendo con una cessione di equivalenti riducenti (ovvero di elettroni e, quindi, di cariche elettriche negative) sarà segnata da una variazione del n. d. o. da un valore più elevato (più
“negativo”) ad uno più basso (più “positivo”), il contrario verificandosi nel caso della riduzione.
Due esempi, tratti, rispettivamente dalla chimica inorganica e dalla chimica organica, possono aiutare a comprendere meglio questi fondamentali
concetti.
E’ ampiamente noto dallo studio della chimica
inorganica che l’immersione di una lamina di zinco
metallico in una soluzione contenente solfato rameico (CuSO4), si accompagna alla generazione di rame metallico. La reazione, un classico esempio di
processo redox, è resa possibile dal fatto che – nel
sistema considerato – lo zinco, nella sua forma metallica, elementare (Zn°), si comporta da agente riducente, ossia cede due elettroni al rame, presente
in forma ionica rameica (Cu2+), riducendolo, appunto, a rame metallico, elementare (Cu°), per liberarsi
alla fine della reazione nella sua forma ionica ossidata (Zn2+) (figura 1. 1).
1. 1 Generalità e definizioni
Le specie chimiche reattive (SCR) sono molecole o atomi, singoli o raggruppati, ovvero ioni, semplici o complessi, accomunati dalla tendenza a reagire più o meno facilmente, in funzione della loro
natura e delle condizioni del mezzo in cui si trovano,
con altre specie chimiche con le quali vengono a
contatto.
Le SCR giocano un ruolo determinante negli organismi viventi, in quanto costituiscono intermedi
obbligati delle reazioni che presiedono ai più importanti processi vitali, quali la trasformazione
dell’energia potenziale contenuta nei nutrienti in
energia chimica di legame, la difesa dall’attacco di
germi patogeni, la detossificazione, la trasduzione di
segnali, etc.
Dato lo stretto legame concettuale esistente fra
SCR e reazioni di ossido-riduzione, è opportuno ricordare che una determinata specie chimica si ossida quando cede uno o più equivalenti riducenti ad
un’altra specie chimica in grado di accettarlo/i e
che, quindi, si riduce.
Nelle reazioni redox è preferibile utilizzare, per
indicare “l’oggetto dello scambio”, il termine più generale di “equivalente riducente”. Quest’ultimo –
esemplificando al massimo il discorso – corrisponde
all’elettrone, nelle classiche reazioni di chimica inorganica, ovvero all’idrogeno atomico (spesso in coppia), nelle classiche reazioni di chimica organica
(vedi oltre).
Utilizzando un linguaggio squisitamente tecnico,
la specie chimica che, al termine della reazione, ha
ceduto l’equivalente riducente e si è, quindi, ossidata, avendo anche – per definizione – reso possibile
la contemporanea riduzione dell’altra, viene detta
“riducente”. Con ragionamento esattamente speculare, la specie chimica che – al termine della stessa
reazione – ha accettato l’equivalente riducente, e si
è quindi ridotta, è chiamata “ossidante”, in quanto
ha reso possibile l’ossidazione dell’altro agente in
gioco.
Le reazioni redox possono essere studiate dal
punto di vista quantitativo con l’ausilio del numero
di ossidazione (n. d. o.), con questo termine intendendosi il numero totale degli elettroni – realmente
o “virtualmente” – ceduti o acquistati nel corso di
una reazione da ciascuna delle due specie chimiche
che ha subito il fenomeno, rispettivamente,
dell’ossidazione o della riduzione.
In pratica, ponendo idealmente in sequenza tutti i numeri di ossidazione immaginabili, dal più ne-
RIDUZIONE
Acquisizione elettroni
+2
RIDUCENTE
0
Cu2+[SO4]2- + Zn° → Cu° + Zn2+[SO4]2OSSIDANTE
0
+2
Cessione elettroni
OSSIDAZIONE
Figura 1. 1 La riduzione del rame ad opera dello zinco
Con discorso speculare, il rame, nella sua forma
ionica rameica (Cu2+), si comporta da agente ossidante, cioè sottrae due elettroni allo zinco metallico
(Zn°), ossidandolo, appunto, a zinco ionico (Zn2+), e
rigenerando se stesso in forma ridotta (Cu°), metallica o elementare. La reazione appare anche stechiometricamente bilanciata. Infatti, 1 atomo di zinco si è ossidato, cedendo 2 elettroni ad 1 ione rameico, ed ha, quindi, mutato il suo n. d. o. da 0
(Zn°) a +2 (Zn2+); viceversa, 1 ione rameico si è
ridotto, acquistando 2 elettroni da 1 atomo di zinco,
ed ha, quindi, subito una variazione del suo n. d. o.
da +2 (Cu2+) a 0 (Cu°).
Merita di essere sottolineato che, da qualunque
dei due punti di vista si consideri la reazione,
l’elemento dello scambio è rappresentato dagli elet-
1
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
troni, che consentendo a chi li acquista di ridursi
sono a ragione definibili “equivalenti riducenti”.
Molto più semplice, almeno in apparenza, il discorso delle reazioni redox in chimica organica, ben
esemplificato in alcune tappe della glicolisi. A questo proposito, è noto che, nella fase finale di tale
via metabolica, quando da una condizione di parziale anaerobiosi la cellula passa ad una condizione di
aerobiosi, l’enzima lattico-deidrogenasi (LDH) catalizza la conversione dell’acido lattico in acido piruvico. In questa reazione, il coenzima della LDH, il nicotinammideadenindinucletide ossidato (NAD+ ) si
comporta da agente ossidante, ossia sottrae una
coppia di atomi di idrogeno all’acido lattico, ossidandolo, appunto, ad acido piruvico, e rigenerandosi sotto forma di nicotinammideadenindinucletide
ridotto (NADH + H+ ) (figura 1. 2).
umano
dalle
conseguenze
indesiderate
di
un’infezione.
In generale, comunque, è alquanto riduttivo –
oltre che scorretto dal punto di vista biochimico –
associare necessariamente l’effetto delle SCR ad un
evento dannoso. Anzi, alcune specie reattive – come l’ossido nitrico (vedi oltre) – sono indispensabili
per la vita, intervenendo direttamente nel mantenimento dell’omeostasi o, addirittura, modulando
l’espressione di taluni geni.
Scopo del presente capitolo è descrivere, a partire dalle diverse modalità di classificazione, le proprietà, il metabolismo ed il ruolo biologico generale
delle principali SCR.
1. 2 Classificazione e proprietà
Le SCR possono essere classificate anzitutto in
base alla natura dell’elemento il cui atomo è direttamente responsabile della loro reattività. Si distinguono, così, SCR centrate sull’ossigeno (Reactive
Oxygen Species, ROS), SCR centrate sul carbonio,
SCR centrate sull’azoto, SCR centrate sul cloro e
SCR centrate sullo zolfo, solo per citare le più rilevanti dal punto di vista biologico.
In ognuna di queste classi, è possibile individuare due sottoclassi, le SCR radicaliche (radicali
liberi) e quelle non radicaliche, sulla base, rispettivamente, della presenza o meno nella loro compagine, di elettroni “spaiati”, ossia disposti singolarmente nei rispettivi orbitali (tabella 1. 1).
RIDUZIONE
Acquisizione atomi idrogeno
CH3
CH3
RIDUCENTE
NAD+ + HO – C – H
[NADH + H+] + C =O
OSSIDANTE
COOH
COOH
Cessione atomi idrogeno
OSSIDAZIONE
Figura 1. 2 L’ossidazione dell’acido lattico ad opera del NAD+
Anche in questo caso, appare evidente come sia
ben appropriato attribuire agli atomi di idrogeno il
significato di equivalenti riducenti, in quanto essi
consentono, a chi li acquisisce, di ridursi.
Analogamente al rame, nella sua forma rameica
(Cu2+), e al nicotinammideadenindinucletide, nella
sua forma ossidata (NAD+ ), nei due esempi sopra
considerati, le SCR agiscono generalmente da agenti ossidanti. Esse, infatti, per la loro intrinseca
natura tendono a sottrarre uno o più equivalenti riducenti ad un gran numero di atomi o molecole con
cui giungono a contatto (22).
Nel corso degli ultimi decenni, le SCR stanno
suscitando un enorme interesse fra gli studiosi. Ciò
è largamente dovuto al fatto che esse, proprio per
la loro più o meno spiccata capacità ossidante, possono indurre, se in eccesso, un particolare tipo di
danno – detto, appunto, ossidativo – che può interessare indiscriminatamente qualsiasi componente
strutturale degli organismi viventi, dai glicidi ai lipidi, dagli amminoacidi alle proteine, dai nucleotidi
agli acidi nucleici, con effetti non sempre prevedibili.
Infatti, l’eccessiva produzione di SCR da parte
dei mitocondri in seguito ad un esercizio fisico strenuo può favorire nell’atleta non allenato la comparsa di e
l sioni articolari o muscolo-tendinee. Invece,
le SCR prodotte in risposta ad un attacco batterico
dai leucociti polimorfonucleati favoriscono la distruzione dei germi patogeni, proteggendo l’organismo
Tabella 1. 1 Specie reattive di maggiore interesse biologico
Specie chimica
Formula Natura
Specie chimica
Formula Natura
O3
N–R
Ossido nitrico
NO ••
R
Anione superossido
O 2 ••
R
Diossido nitrico
NO 2 ••
R
1
*
Ossigeno singoletto
O2
R (?)
Acido nitroso
HNO 2
N–R
Perossido di idrogeno
H2 O 2
N–R
Tetrossido di azoto
N2 O 4
N–R
Idrossile
HO ••
R
Triossido nitrico
N2 O 3
N–R
••
Alcossile
RO
R
Acido perossinitroso
ONOOH
N–R
••
(Alchil)idroperossile
ROO
R
Perossinitrito
ONOO
N–R
(Alchil)idroperossido
ROOH
N–R
Alchil-perossinitrito
ROONO
N–R
••
2+
Alchile
R
R
Catione nitronio
NO
N–R
••
Semichinone (da CoQ)
Q
R
Acido ipocloroso
HClO
N–R
••
••
Tocoferile (da vit. E)
E-O
R
(Alchil)tiile (da R–SH)
RS
R
N-R: specie non radicalica. R: specie radicalica.*Stato energetico attivato.
Ozono
A questo proposito, appare evidente quanto sia
estremamente riduttivo associare il concetto di SCR
ai cosiddetti radicali liberi e, nella fattispecie, ai soli
radicali liberi dell’ossigeno.
Infatti, come illustrato nella tabella 1. 1 le SCR
comprendono agenti centrati anche su elementi diversi dall’ossigeno e di natura non necessariamente
radicalica.
Nella presente trattazione, tuttavia, qualora non
specificamente indicato, si farà costante riferimento
alle specie – radicaliche e non – centrate
sull’ossigeno. Quest’ultimo, infatti, oltre ad essere
uno degli elementi quantitativamente più importanti della materia vivente, nonché la fonte primaria
della vita stessa, induce continuamente, attraverso
una serie di meccanismi – non ultimo la stessa respirazione cellulare – la formazione di specie chimiche con caratteristiche più o meno spiccate di reat2
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
potentissimo ossidante. Viceversa, il trifenilmetile
[(C6H5)3–C•] e la difenilpicrilidrazide sono radicali
che, in opportune condizioni, possono essere persino isolati in soluzione, proprio per la loro relativa
stabilità o inerzia chimica (figura 1. 5) (28).
+2.0
+1.5
+1.0
E 7 (R • + e - →R)
tività, di fondamentale importanza per l’omeostasi
dell’intero organismo.
Tornando alle SCR radicaliche, queste si identificano – come si è accennato – con i cosiddetti radicali liberi o, più semplicemente, radicali. Sotto questa denominazione sono compresi atomi o raggruppamenti di atomi aventi in uno degli orbitali esterni
delle specie che li costituiscono uno o più elettroni
spaiati (figura 1. 3) (3, 6, 12).
Potenziale redox
HO •
RO •
RS•
O2 •
Asc •
SeQ •
Cl•
Radicale idrossile
Atomo di cloro
Radicali molto reattivi
(elevato rapporto carica/superficie)
ROO •
+0.5
Carica/superficie
HO•
NAD •
NO 2
0
=COH•
-0.5
N
1.0
Ne
O
O
-1.5
H
O2 N
C(NO 2 )4
CO 2
E 7 (R • → R + e - )
-1
L’atomo di Ne
Solo elettroni appaiati
L’atomo di O
Due elettroni spaiati
Atomo (stabile)
Tale condizione può sussistere a prescindere
dalla carica elettrica globalmente espressa dalla
specie chimica. Per esempio, il radicale della N,Ndietilparafenilendiammina, il substrato cromogeno
del d-ROMs test (vedi in seguito), è un classico radicale catione, cioè carico positivamente (1).
In funzione della distribuzione della carica (nube elettronica) e/o del proprio potenziale di ossidoriduzione, i radicali liberi presentano una reattività
più o meno spiccata, legata alla tendenza spontanea ad esistere come entità aventi tutti gli elettroni
disposti in coppie, condizione che corrisponde alla
stabilità o inerzia chimica (28). Ne deriva – in antitesi all’opinione comune – che è riduttivo considerare i radicali come specie chimiche tutte ugualmente
ed indiscriminatamente molto reattive. In genere,
quanto più è elevato il rapporto fra carica e volume,
tanto più un radicale libero è reattivo e, pertanto,
tenderà a raggiungere la propria stabilità strappando elettroni a qualsiasi specie chimica con la quale
viene a contatto (specialmente se questa presenta
elettroni “disponibili”, come quelli impiegati in doppi
legami C-C) ossidandola (compatibilmente con il suo
potenziale di ossido-riduzione) (figura 1. 4) (28).
Radicale
(ossidante)
+
C
C
Molecola bersaglio
(es. doppio legame C-C)
+
Nuova molecola
(ridotta, stabile)
C
+0.5 +1.0 +1.5 +2.0
CH 3 -CH 2
N
CH 3 -CH 2
Base amminica
INCOLORE
CH3 -CH2
NH 2
N
+
NH2
CH3 -CH2
Radicale catione
COLORATO (ROSA)
Idrogeno
Carbonio
Azoto
Figura 1. 6 La N.N-dietilparafenilendiammina e il suo radicale
Lo stesso dicasi per il radicale catione del 2,2azino-di-(3-etilbenziltiazolo) sulfonato (ATBS ®), il
substrato cromogeno del test TAS (Total Antioxidant Status, Randox).
I radicali liberi vengono classificati sulla base
della natura dell’atomo al quale appartiene l’orbitale
con l’elettrone spaiato (tabella 1. 1).
Tra questi assumono particolare rilevanza biologica i radicali liberi centrati sull’ossigeno o, più
semplicemente,
radicali
liberi
dell’ossigeno,
nell’ambito dei quali merita un discorso a parte il
cosiddetto ossigeno singoletto (1O2* ), da non confondersi con l’anione superossido (O2•) A questo
proposito, giova ricordare che l’ossigeno molecolare (O2), in quanto portatore di due elettroni spaiati
ma con spin paralleli negli orbitali esterni, presenta
una natura diradicalica che ne limita fortemente la
reattività. Tuttavia, quando questi elettroni più esterni riescono ad assorbire una sufficiente quota di
Elettrone spaiato
A
0
Difenilpicrilidrazide (DPPH)
Un radicale poco reattivo
(basso rapporto carica/superficie)
Di quest’ultimo fenomeno trae vantaggio la biochimica analitica nella messa a punto di test per la
valutazione dello stress ossidativo.
Per
esempio,
la
citata
N,N-dietilparafenilendiammina, che è incolore, messa in contatto
con un radicale libero a più basso potenziale redox
(es. l’idroperossile), cede a questi un elettrone, cioè
si ossida. Il corrispondente radicale catione, dato il
suo elevato rapporto superficie/carica è stabile e,
godendo della proprietà di colorarsi in rosa nel momento in cui avviene l’ossidazione, può essere agevolmente identificato e quantificato spettrofotometricamente, come nel d-ROMs test (vedi in seguito)
(figura 1. 6) (1).
Radicali liberi dell’ossigeno (instabili)
Figura 1. 3 Atomi e radicali
A
-0.5
NO 2
Figura 1. 5 Basi elettrochimiche della reattività radicalica
.
Il radicale idrossile (HO )
Un elettrone spaiato
OSSIDAZIONE
N
C
Nuovo radicale
(ossidante)
Figura 1. 4 L’azione ossidante dei radicali liberi
In tal senso, il radicale ossidrile (HO •) è uno dei
radicali liberi più instabili e, quindi, reattivi
ed ossidanti. Infatti, la durata stimata della sua esistenza è dell’ordine dei nanosecondi (28). Lo stesso
discorso vale per il cloro allo stato atomico (Cl•), un
3
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
energia, essi possono andare incontro o ad
un’inversione di spin o ad un salto di orbitale (transizione), generando un nuovo stato dell’ossigeno
estremamente reattivo che è denominato, appunto,
ossigeno singoletto (1O2* ).
Tra i radicali liberi centrati sull’azoto va citato il
cosiddetto ossido nitrico, che andrebbe chiamato
più correttamente ossido d’azoto (figura 1. 7).
d’idrogeno) a –2 (nell’acqua e nell’acido ipocloroso). Viceversa, il n. d. o. del cloro passa da –1
(nell’acido cloridrico) a +1 (nell’acido ipocloroso).
In modo del tutto analogo si comportano le SCR
non radicaliche centrate sull’azoto (es. acido nitroso) e sugli altri atomi (carbonio, alogeni e zolfo).
Una proprietà che accomuna le SCR e, in particolare, i radicali liberi, è quella di dar luogo, in opportune condizioni ambientali, ad una serie di reazioni a catena a 3 step – inizio, propagazione e termine – nel corso delle quali il sito radicalico può essere trasferito o, eventualmente, inattivato (figura
1. 4) (18, 26, 28).
N O
Fotolisi/
pirolisi
F e2+
+hν
Scissione
di perossidi
Scissione di
azocomposti
RO : OR
RN
: : NR
+hν
– N2
AO• + OB -
RO• + • OR
R• + •R
Trasferimento
Addizione
Frammentazione
Ri -arrangiamento
A•
R•
R:C – C*=
R:C – C*=
A • + •B
R:H
Propagazione
Infatti, “ossido nitrico” è la traduzione italiana
dell’anglosassone “Nitric Oxide”, la cui sigla (NO),
tra l’altro, per una singolare coincidenza, ne esprime anche la formula bruta. A voler essere rigorosi,
tuttavia, nessuno dei 5 ossidi dell’azoto è definito
“nitrico” nella nostra nomenclatura ufficiale!
Le SCR di natura non radicalica sono caratterizzate dal possedere una struttura di tipo molecolare,
nella quale gli elettroni sono tutti disposti – al contrario dei radicali liberi – in coppie, generalmente
impegnati a formare legami di tipo covalente tra i
vari atomi costituenti.
L’azione ossidante è evidenziata, anche in questo caso, dal passaggio del n. d. o. della specie reattiva verso un valore “più negativo”. Un classico
esempio, al riguardo, è fornito dalla reazione catalizzata dalla mieloperossidasi, nella quale il perossido di idrogeno (H2O2), una SCR di natura non radicalica centrata appunto sull’ossigeno, ossida il cloruro (Cl-) – liberatosi in soluzione dalla ionizzazione
dell’acido cloridrico (HCl) – generando acido ipocloroso (HClO) ed acqua (figura 1. 8).
CH2 =CH–
=C = C =
A:H
R•
R–CH2 –CH* –
Combinazione
A • + •B
Termine
R•
=C* – C:R
Disproporzione
–C•– –C•–
+
–C–
–C–
–C=
A
:B
–C –
+
–C=
–C –
Figura 1. 9 Schema delle reazioni radicaliche a catena (28)
1. 3 Meccanismi di generazione
Le SCR, siano esse di natura radicalica o non
radicalica, possono essere generate attraverso due
principali tipi di meccanismi: quelli enzimatici e
quelli non enzimatici (18).
I meccanismi di tipo enzimatico presuppongono, per definizione, la generazione di SCR nel contesto di un sistema vivente, ove sono disponibili,
appunto, gli enzimi. Anzi, spesso per effetto di agenti esogeni (vedi in seguito), le cellule producono
continuamente SCR nel corso della loro “fisiologica
attività” metabolica (5-7, 25).
A questo proposito, è possibile individuare almeno 5 fonti metaboliche primarie di SCR, in rapporto al sito cellulare prevalentemente interessato
nella produzione delle specie reattive stesse: la plasmamembrana, i mitocondri, i perossisomi, il reticolo endoplasmatico liscio (microsomi) e il citosol. (figura 1. 10) (24).
RIDUZIONE
Acquisizione elettroni
RIDUCENTE
AO : OB
F e3+
Figura 1. 7 Formula schematica dell’ossido d’azoto
-1
Interazione con
metalli di transizione
A: B
Inizio
-2
H2O2 + HCl
→ H2O + HClO
-1
+1
OSSIDANTE
Cessione elettroni
OSSIDAZIONE
NADPH ossidasi
Lipoossigenasi
NADH deidrogenasi
Citocromo ossidasi
Xantina ossidasi
Aldeide ossidasi
Citocromo P450
Citocromo b5
Figura 1. 8 La reazione redox catalizzata dalla mieloperossidasi
In tale reazione, i due atomi di ossigeno dell’
H2O2 strappano “virtualmente” due elettroni allo
ione Cl-. L’ossigeno, acquistando elettroni dal cloro,
si riduce, comportandosi da ossidante; contemporaneamente, il cloro, cedendo elettroni all’ossigeno,
si ossida, comportandosi da riducente. Pertanto, il
n. d. o. dell’ossigeno passa da –1 (nel perossido
Figura 1. 10 Fonti cellulari primarie di produzione di SCR
4
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
La produzione di SCR da parte della plasmamembrana è tipica, anche se non esclusiva, delle
cellule infiammatorie, quali, ad esempio, i leucociti
polimorfonucleati (PMN). Infatti, nella membrana
cellulare di questi ultimi sono localizzati diversi enzimi, quali la NADPH ossidasi e le lipoossigenasi, la
cui attivazione si accompagna alla produzione, rispettivamente di anione superossido e di intermedi
metabolici con caratteristiche chimiche di perossidi
(24).
La NADPH ossidasi catalizza la formazione di
anione superossido da NADPH(H+ ) ed ossigeno molecolare, in seguito a stimolazione specifica dei
PMN, per esempio da parte di endotossine, batteri,
o anticorpi. La reazione, che avviene verosimilmente in due tappe, è resa possibile dall’aumentata disponibilità di NADPH(H+ ), per l’aumentata ossidazione del glucosio attraverso
lo shunt degli
esosi, e
di ossigeno molecolare, nell’ambito del
cosiddetto “respiratory burst”.
Il sistema della lipoossigenasi, localizzato
anch’esso a livello della plasmamembrana, comprende tre enzimi, la 5-, la 12-, e la 15lipoossigenasi, che catalizzano la formazione, a partire dall’acido arachidonico, degli acidi 5-, 12- e
15-idroperossieicosatetraenoico
(Hydro-PeroxyEicosa-Tetra-Enoic, HPETE), rispettivamente (29).
Queste sostanze appartengono agli idroperossidi
acidi, un gruppo particolare di ROS spesso indicati
con la sigla di ROM (reactive oxygen metabolites,
cioè metaboliti o derivati reattivi dell’ossigeno).
La produzione di ROS a livello della plasmamembrana dei PMN, per attivazione della NADPH
ossidasi e/o delle lipossigenasi, avviene, tipicamente, nel corso di processi reattivi (es. infezioni, immunoreazioni patogene, infiammazioni).
I mitocondri rappresentano la fonte metabolica
primaria di ROS perché sulle loro creste sono localizzati i complessi enzimatici della catena respiratoria deputati alla fosforilazione ossidativa (18).
Idealmente, il trasferimento di elettroni dal
NAD ridotto al citocromo C e da questo all’ossigeno
dovrebbe concludersi, una volta sintetizzato l’ATP,
con la produzione di H2O (riduzione tetravalente
dell’ossigeno molecolare) (18).
Tuttavia, già in condizioni normali, questo processo non è perfetto, per cui in maniera non facilmente controllabile una certa quota di elettroni (12%) sfugge al sistema di trasporto dei vari coenzimi
(es. ubichinone, flavoproteine, citocromi, ecc.) e reagisce direttamente con l’ossigeno molecolare, generando, così, anione superossido e /o perossido di
idrogeno (riduzione uni- e bivalente dell’ossigeno
molecolare) (18).
Per avere un’idea di questo processo, si consideri che è stato calcolato che durante un esercizio
fisico intenso nei muscoli scheletrici, a causa
dell’intensa stimolazione metabolica cellulare la
quota di questo shunt elettronico può raggiungere il
15% dell’ossigeno utilizzato dai mitocondri (figura
1. 11) (18).
Riduzione tetravalente “( la regola”)
1e-
O2
O2.
1e -
1e -
H2O2
2 H+
Riduzione
univalente
Riduzione
univalente
HO.
1e-
H 2O
1H+
Riduzione bivalente
Riduzione bivalente
Riduzioni uni- e bi-valente (“le eccezioni”)
Figura 1. 11 Modalità di riduzione dell’ossigeno molecolare
Oltre alla plasmamembrana ed ai mitocondri,
anche i perossisomi rappresentano una fonte importante di ROS. In questi organuli cellulari, infatti, avviene un particolare processo di ossidazione degli
acidi grassi, che è diverso da quello convenzionale
(β-ossidazione). Nella prima tappa di tale sequenza
di reazioni, una flavoproteina estrae una coppia di
atomi di idrogeno da una molecola di acido grasso
attivato
(acil-CoA)
trasferendola
direttamente
all’ossigeno molecolare, con formazione di perossido di idrogeno (successivamente inattivato dalla catalasi).
Nel reticolo endoplasmatico (microsomi) la produzione di specie reattive passa attraverso il citocromo P450. Quest’ultimo gioca un ruolo di primo
piano nei processi di detossificazione (19, 20, 24).
Il citocromo P450 agisce come donatore immediato di elettroni in molte idrossilazioni, in particolare quelle che avvengono all’interno degli epatociti e
che sono finalizzate all’inattivazione di ormoni (es.
steroidei) e composti non fisiologici (xenobiotici,
quali tossici e farmaci idrofobici che vengono in tal
modo resi più solubili e meno tossici) (24).
Il citocromo P450 è una proteina a ferro eminico
presente non solo nel reticolo endoplasmatico del
fegato ma anche nei mitocondri della corticale del
surrene che, in un processo molto complesso e non
ancora perfettamente chiarito, fa da trait-d’union
fra l’NADPH(H+ ) (donatore di elettroni) e substrato
da idrossilare (24). In tale complessa reazione un
substrato idrossilabile (SH) reagisce con NADPH(H+ )
ed ossigeno molecolare (O2) per formare il corrispondente derivato idrossilato (S-OH), insieme a
NADP+ ed acqua.
Infine, il citosol può essere sede di produzione
di SCR, in condizioni sia fisiologiche che patologiche
(es. generazione di ROS da parte della xantina ossidasi nel cosiddetto danno da ischemia-riperfusione,
vedi capitolo terzo) (24).
Altre reazioni enzimatiche in grado di generare
SCR sono descritte nella sintesi delle catecolammine
(24) e nell’ossidazione dei cloruri (figura 1. 8).
Nelle stesse sedi cellulari nelle quali l’attività di
specifici enzimi comporta la generazione di SCR attraverso un meccanismo catalitico di tipo “biologico”, è possibile rilevare la produzione di un gran
5
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
numero di specie reattive variamente centrate, grazie all’attivazione di meccanismi non enzimatici. Fra
questi ultimi assumono maggiore rilevanza la scissione omolitica e l’interazione con i metalli di transizione, sui quali maggiormente ci si soffermerà nella
presente trattazione (figura 1. 9) (28).
Non meno importanti, comunque, appaiono la
scissione dei perossidi – dalla quale, per somministrazione di energia, originano radicali alcossilici – e
la decomposizione degli azocomposti, dalla quale
sono prodotti – per sottrazione di azoto molecolare
(N2) – radicali alchilici (figura 1. 9) (28).
La scissione omolitica consiste nella divisione di
una molecola a livello di uno dei suoi legami covalenti per effetto della somministrazione di energia
(termica, pirolisi, o radiante, radiolisi) con generazione di due nuove specie chimiche, ciascuna
con un elettrone spaiato, elemento distintivo dei radicali liberi (figura 1. 12, A).
di una molecola bersaglio, che si decompone in un
radicale libero ed un catione (figura 1. 13) (1, 13,
14).
Men
A
B
Energia
Molecola
+
A
Radicale libero 1
B
Cl
Molecola
Acqua
H
Catione
Anione
+
+
A
Radicale libero
B
Catione
Figura 1. 13 Interazione con metalli di transizione
Attraverso questo meccanismo, per esempio, il
ferro (Fe2+/Fe3+) oppure il rame (Cu+ /Cu2+) agiscono da catalizzatori in una sequenza di reazioni di
ossido-riduzione generando, a partire dai perossidi,
radicali liberi (13, 14, 16).
Nel caso più semplice – descritto per la prima
volta da Fenton – uno ione ferroso (Fe2+), ossidandosi a ione ferrico (Fe3+), cede il suo elettrone ad
una molecola di perossido di idrogeno (H2O2) e ne
scinde uno dei legami covalenti, generando un ra•
dicale libero (il radicale idrossile, HO ) ed un anione
(ione ossidrile) (13,14, 16, 27).
A sua volta, lo ione ferrico (Fe3+) si riduce – rigenerandosi come qualsiasi catalizzatore – a ione
ferroso (Fe2+), strappando un elettrone da una seconda molecola di perossido di idrogeno, che è scissa in un radicale libero (un radicale peridrossile
•
(HOO ), e un catione (uno ione idrogeno, H+ ) (figura 1. 14) (13, 14, 16).
Radicale libero 2
-
+
B
Men-1
B
Molecola
B
+
H
Radicale libero
Men
A
-
+
A
Molecola
A
A
Men+1
B
Cl
Anione
Figura 1. 12 Scissione omolitica (A) e ionizzazione (B)
E’ bene sottolineare che la scissione omolitica
è diversa dalla ionizzazione, che si osserva, per esempio, dopo aver disciolto in acqua molecole, come quelle dell’acido cloridrico (HCl), aventi almeno
un legame covalente polarizzato. In questo caso, le
molecole d’acqua, a causa della loro polarità e,
dunque, senza alcuna somministrazione di energia,
riescono a spezzare uno dei legami covalenti polarizzati della molecola di soluto generando due specie chimiche caricate di segno opposto, un catione
ed un anione (H+ e Cl-, rispettivamente,
nell’esempio considerato). E’ altresì evidente che
nella ionizzazione, al contrario della scissione omolitica, il doppietto elettronico di legame della molecola originaria non viene separato ma resta come tale
in una delle “neonate” specie ioniche (l’anione). (figura 1. 12, B).
Un classico esempio di scissione omolitica è la
radiolisi o fotolisi dell’acqua che genera un atomo
di idrogeno ed un radicale idrossile (7).
Nell’interazione con i metalli di transizione,
l’elettrone generato dall’ossidazione di un metallo di
transizione in forma ionica (es. da Fe2+ a Fe3+ o da
Cu+ a Cu2+) spezza un legame covalente di una molecola bersaglio, generando così un radicale libero e
un anione (1, 13, 14, 16, 27). Alternativamente,
l’elettrone richiesto per ridurre un metallo di transizione in forma ionica (es. da Fe3+ a Fe2+ o daCu2+ a
Cu+ ) viene estratto dal legame covalente
OHH–O•
H–O–O–H
Perossido
di idrogeno
Fe2+
Fe3+
H–O–O•
Radicale
peridrossile
Radicale
idrossile
H–O–O–H
Perossido
di idrogeno
H+
Figura 1. 14 Decomposizione del perossido di idrogeno
Allo stesso modo, anche gli idroperossidi sono
scissi, per azione catalitica del ferro, in radicali al•
•
cossilici (RO ) e perossilici (ROO ) (figura 1. 15) (1).
-
OH
R-O-O-H
(Alchil)
idroperossido
R-O
Fe 2+
.
R-O-O
Radicale
(idro)perossilico
Fe 3+
.
Radicale
alcossilico
R-O-O-H
H
+
(Alchil)
idroperossido
Figura 1. 15 Decomposizione degli idroperossidi
6
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
(R–H), strappa a questa un atomo di idrogeno, generando, accanto ad una molecola d’acqua (H2O),
un radicale alchilico (R•) (figura 1. 16, B). Così, il
sito radicalico si trasferisce dal radicale ossidrile al
radicale alchile. Tale reazione è alla base del cosiddetto danno ossidativo (vedi capitolo terzo).
Meccanismi di propagazione sono noti anche
per SCR non radicaliche. Per esempio, il perossido
di idrogeno genera, per azione della mieloperossidasi, l’acido ipocloroso che, a sua volta, può ossidare i gruppi amminici degli amminoacidi o delle proteine per produrre cloroammine, importanti marker
di danno ossidativo cellulare.
Nel ciclo di reazioni descritto, assume rilevante
importanza la rigenerazione dei metalli di transizione allo stato ridotto, che è affidata ad un complesso
indicato con la sigla MCO (sistema di ossidazione
metallo-catalizzata) (27). Esso comprende la xantina ossidasi, la NADPH e la NADH ossidasi, l’acido
nicotinico idrossilasi, il sistema del citocromo P450, la
NADH reduttasi (coenzima chinonico), la succinicoreduttasi (coenzima chinonico) e varie proteine a
ferro-zolfo non eminico. I chinoni e i gruppi prostetici flavinici ridotti generati da questi enzimi riducono a loro volta i metalli di transizione, provocando
la riduzione diretta dell’ossigeno molecolare a radicale idrossile e/o a perossido di idrogeno (attraverso la mediazione o meno dell’anione superossido)
(figura 1. 16) (27).
1. 5 Meccanismi di terminazione
Una reazione radicalica a catena può arrestarsi
(termine, step 3) o per combinazione o per disproporzione. In particolare, nella combinazione, che è
la reazione inversa della scissione omolitica, due radicali liberi reagiscono tra loro dando luogo ad una
molecola non più reattiva (figura 1. 17) (28).
FH 2
QH2
O2
QH*, H2H+
QH*, HO2*
x2
Fe(III)
O2
O2
H2 O 2
Fe(II)
FH+
F
*OH + OH - + Fe (III)
Figura 1. 15 Sistemi MCO e ciclo del ferro
R
Infine, è opportuno sottolineare che anche in
assenza di catalizzatori o di fonti energetiche è talvolta possibile generare radicali liberi. Per esempio,
i perossinitriti generano spontaneamente radicale
idrossile e radicale nitrossido.
Radicale libero 1
(ossidante)
Radicale libero
(ossidante)
H
A
Molecola
bersaglio
+
H
Nuova
molecola
Radicale
ossidrile
H
+
R
Substrato
organico
H
R
+
Nuova
molecola
Le più comuni specie reattive di interesse biologico sono quelle centrate sull’ossigeno, sull’azoto,
sul carbonio e sul cloro (tabella 1. 1).
Tra le specie reattive primarie dell’ossigeno,
l’ossigeno singoletto rappresenta una varietà radicalica che può originarsi per eccitazione dell’ossigeno
molecolare o per combinazione di radicali perossilici
(figura 1. 18) (2).
R
Nuovo radicale
(ossidante)
H
Radicale
alchile
O
2 ROO•
O2
B
O
Radicale libero 2
(antiossidante )
R1
1. 6 Metabolismo e ruolo biologico
A
R
R
Questo meccanismo viene sfruttato per bloccare
una reazione radicalica e in generale, un qualsiasi
processo radicalico a catena può essere interrotto
grazie all’intervento di agenti denominati antiossidanti (vedi in seguito).
Si distinguono 4 meccanismi fondamentali di
propagazione delle reazioni radicaliche: trasferimento, addizione, frammentazione e riarrangiamento
(28).
Tra questi, il più comune nell’ambito delle reazioni radicaliche è il trasferimento. In tale modalità,
il radicale libero – generato da una delle precedenti
reazioni di inizio – attacca una molecola sottraendo
ad essa uno dei suoi atomi (generalmente un atomo
di idrogeno). Il risultato finale è la formazione di
una nuova specie reattiva e, in pratica, il trasferimento del sito radicalico (figura 1. 16A).
+
R1
Figura 1. 17 Reazione di combinazione
1. 4 Meccanismi di propagazione
A
+
H
Acqua
Eccitazione
1O
2
Combinazione
Figura 1. 16 Reazione di trasferimento
Con questo meccanismo, per esempio, il radicale ossidrile (HO •) attaccando una molecola organica
Figura 1. 18 Modalità di generazione dell’ossigeno singoletto
7
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
tivato o dà luogo alla formazione di specie chimiche
più ossidanti (figura 1. 21) (2).
L’anione superossido viene generato per riduzione dell’ossigeno molecolare, ossia per addizione
alla molecola dell’ossigeno di un elettrone, il quale
può provenire da diverse vie metaboliche (figura 1.
19) (11).
Respirazione
polmonare
NADPH
ossidasi
Citocromi
P450 e 5 b
Ossidazione
mista NADPH
Catena
respiratoria
O2
Respirazione
polmonare
O2
Autoossidazione
Ossidazione mista
ipoxantina
e
Xantina
ossidasi
Riduzione univalente
Reazione di Haber -Weiss
O2
Figura 1. 19 Metabolismo dell’anione superossido
H2O
O2
Catena
respiratoria
Riduzione univalente
RH
H2O2
Radiolisi
Reazione
di Fenton
HO••
H2 N
Scissione
spontanea
ClO -
H2O
Le specie reattive primarie dell’ossigeno (reactive oxygen species, ROS) appena descritte possono
attaccare qualsiasi substrato organico, generando
specie reattive secondarie, note anche come metaboliti o derivati reattivi dell’ossigeno (reactive oxygen metabolites, ROM), quali gli idroperossidi
(ROOH). Questi, a loro volta, in particolari condizioni, possono dare origine a specie chimiche ancora
più instabili, quali i radicali perossile e alcossile,
mediatori finali del danno ossidativo (vedi capitolo
terzo)(1).
Le specie reattive centrate sull’azoto di maggiore rilevanza biomedica comprendono varietà sia radicaliche che non radicaliche. Fra le prime sono da
citare l’ossido d’azoto, impropriamente detto ossido
nitrico (NO•), e il biossido nitrico (NO2•); fra le seconde, piuttosto numerose, ricordiamo, invece,
l’acido nitroso e il perossinitrito.
L’ossido nitrico, un gas considerato a lungo un
inquinante ambientale, viene prodotto, insieme alla
L-citrullina, a partire dall’amminoacido L-arginina, in
una reazione catalizzata dall’enzima ossido nitrico
sintetasi (nitric oxide synthase, NOS) (17).
Quest’ultimo possiede la singolare proprietà di ospitare sulla stessa catena polipeptidica due domini ad
azione catalitica, uno reduttasico ed uno ossigenasico, e richiede come cofattori NADPH e pteridina ridotta (8). La NOS esiste in almeno 2 isoforme, una
costitutiva (cellule endoteliali, piastrine, neuroni) ed
una inducibile (cellule infiammatorie) (figura 1. 22).
Infatti, nel corso della respirazione, il sistema di
trasporto degli elettroni genera, normalmente, a livello mitocondriale, modeste ma significative quantità di anione superossido per riduzione univalente
dell’ossigeno molecolare (figura 1. 11). Con analogo
meccanismo, nel corso del cosiddetto “respiratory
burst” i leucociti polimorfonucleati producono anione superossido dall’ossigeno molecolare per attivazione dell’enzima NADPH ossidasi di membrana (vedi sopra). Anche condizioni di ischemia-riperfusione,
attraverso la xantina ossidasi generano anione superossido (vedi sopra). Quest’ultimo, una volta prodotto, può andare incontro alla reazione di HaberWeiss, generando il radicale altamente istolesivo
idrossile, oppure dismutare, per azione della SOD, a
perossido di idrogeno, meno tossico (vedi in seguito).
Il radicale idrossile, noto per la sua enorme potenzialità istolesiva, può derivare da un’ampia serie
di reazioni, tra le quali spiccano la catena respiratoria, la fotolisi dell’acqua (vedi in seguito), la decomposizione del perossido di idrogeno, la scissione
spontanea dei perossinitriti e la reazione dell’ozono
con i fenoli (figura 1. 20) (9, 10).
Reazione di
Haber-Weiss
Catena
Ossidazione mista Xantina
H2O2 ipoxantina
respiratoria
ossidasi
Riduzione bivalente
Reazione di
MieloHaber-Weiss
Catalasi Perossidasi
perossidasi
Figura 1. 21 Metabolismo del perossido di idrogeno
Superossido dismutasi
H2O 2
O2*
Amminoacido
ossidasi
HO••
HO••
Respirazione
polmonare
Superossido
dismutasi
NH
H2N
N–OH
H2N
O
HONOO
NH
Reazione con ozono
NH
NADPH
O2
NH
NADPH
O2
+ NO
Fenoli
H2 O
H3N+
R ••
COO-
L-arginina
Figura 1. 20 Metabolismo del radicale idrossile
H3N+
COO-
N-idrossiarginina
H3N+
COO-
L-citrullina
Figura 1. 22 Biosintesi (schematica) dell’ossido nitrico
Infine, il perossido di idrogeno viene generato
prevalentemente attraverso meccanismi di tipo enzimatico e per via enzimatica è generalmente inat-
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come un importante messaggero intra- ed inter-cellulare rego8
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
lando molte funzioni quali la pressione arteriosa, la
respirazione, la coagulazione del sangue, e alcune
attività cerebrali (17). Esso, inoltre, gioca un ruolo
determinante nella difesa dalle infezioni batteriche e
nella prevenzione dei tumori (30). Tuttavia, se generato in quantità abnormi esso è anche un potente
killer cellulare.
Nell’NO gli elettroni spaiati del livello energetico
più esterno (cinque appartenenti all’azoto e sei
all’ossigeno) generano una specie chimica non carica, dotata di proprietà paramagnetiche e, dunque,
un radicale (figura 1. 7) (17).
In quanto radicale libero, l’NO reagisce rapidamente con altre specie aventi elettroni spaiati;
l’effetto può essere un’ossidazione, una riduzione
oppure il legame con altre molecole, in funzione del
microambiente (figura 1. 23) (17).
⇔O
⇔ 2•
N2O3
pH<7
NO2-
L-citrullina
R-SH / R-NH 2
RS–NO
RNH–NO
O2//H2O
NO••
NO–Hb
Met–HB
O2 ••
ONOO-
L-arg
NOS
ONOO -
NO•
NO•
FUNZIONI NORMALI
FUNZIONI ALTERATE
Così,
sebbene
il
perossinitrito
svolga
un’importante azione microbicida e tumoricida, la
generazione di un suo eccesso si accompagna a lesioni tissutali di tipo ossidativo. Specificamente, il
perossinitrito è responsabile della nitrazione dei residui fenolici delle tirosine, che conduce alla formazione di nitrotirosina, un marker della tossicità tissutale dell’NO. A pH neutro, il perossinitrito, genera, a
sua
volta,
l’acido
perossinitroso
(ONOOH).
Quest’ultimo può attaccare diverse molecole con
produzione secondaria di radicale idrossile ed altri
intermedi reattivi.
Tuttavia, in quanto radicale libero, l’NO può anche svolgere un’attività antiossidante, come scavenger dei radicali alcossilici e perossilici. La prevalenza dell’una o dell’altra azione dipende dalle concentrazioni relative delle singole specie reattive implicate.
Oltre alle specie reattive dell’ossigeno e
dell’azoto, assumono rilevante importanza, infine, i
radicali centrati sul carbonio (importanti intermedi
della perossidazione lipidica) e le specie reattive del
cloro (in particolare l’acido ipocloroso, responsabile
della formazione delle cloroammine) (15, 31).
Da quanto esposto finora, si evince che le SCR
rappresentano intermedi quasi obbligati del metabolismo cellulare. E poiché la loro produzione è
strettamente legata ai fenomeni vitali, a ragione esse sono state definite “insostituibili compagne di
viaggio” della nostra esistenza (4).
In altri termini, la generazione di specie reattive
negli organismi viventi è strettamente legata ai fenomeni vitali e, pertanto, costituisce un fenomeno
“fisiologico” che avviene continuamente nel corso
delle varie reazioni di ossidoriduzione, in presenza o
meno di enzimi o metalli di transizione (18).
In ciascun sito cellulare (vedi sopra), la produzione di specie reattive ha una sua specifica funzione. Infatti, è ampiamente riconosciuto che le SCR
giocano un ruolo importante “al servizio della vita”
perché sono coinvolte non solo nel metabolismo
cellulare ma anche nei “processi reattivi”, quali infezioni e infiammazioni.
Per esempio, i leucociti attivati generano a livello della propria plasmamembrana anione superossido ed altre specie reattive centrate sull’ossigeno,
che attaccheranno componenti estranei, quali i batteri, indebolendone la parete e rendendoli più facil-
NOS
Redox
⇑O
⇑ 2•
Figura 1. 24 Ossido nitrico, anione superossido e prossinitrito
L-arginina
NO3-
L-arg
NOS
Guanilciclasi ↑↑
COX ↑↑
Cit P450 ↓↓
Figura 1. 23 Principali vie metaboliche dell’ossido nitrico
In particolare, nei sistemi acquosi e all’interfacie
aria-liquido, la generazione di NO si accompagna
alla produzione di nitriti (NO2-) e nitrati (NO3-) come
prodotti terminali.
Reagendo con l’ozono, invece, l’NO forma un
derivato chemiluminescente e da ciò trae vantaggio
una speciale tecnica analitica.
Tra i vari destini metabolici, riveste particolare
importanza ai fini della patogenesi dello stress ossidativo la reazione dell’ossido nitrico con l’anione superossido, dalla quale viene generato l’anione, altamente reattivo, perossinitrito (ONOO-).
Infatti, in condizioni normali, l’NO prodotto dalle
cellule (es. quelle endoteliali) diffonde rapidamente
ai tessuti viciniori (es. muscolatura liscia vasale,
leucociti polimorfonucleati, piastrine) esercitando la
sua azione fisiologica protettiva (vasodilatazione,
riduzione dell’adesività leucocitaria e dell’aggregabilità piastrinica, etc.).
Tuttavia, quando la produzione di anione superossido aumenta, questo reagisce massivamente
con l’ossido nitrico, trasformandolo in perossinitrito
(17).
Le conseguenze negative di questo fenomeno
sono
duplici: riduzione della biodisponibilità
dell’ossido nitrico ed innesco di effetti tossici, con
alterazioni cellulari funzionali e/o strutturali (figura
1. 24) (21, 23).
9
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
mente accessibili ai meccanismi di killing fagocitario.
La medesima strategia viene anche utilizzata
nel corso della guarigione di organi o tessuti soggetti a traumi. Infatti, i leucociti migrati nell’area
lesa, una volta attivati, iniziano a “bombardare”,
con le loro specie reattive, le cellule danneggiate,
accelerandone la distruzione, l’allontanamento dei
sottoprodotti di lisi e, quindi, il corrispondente recupero (rigenerazione) (18).
Purtroppo, queste attività di tipo “immunologico” possono estrinsecarsi non solo nei confronti di
componenti estranei ma anche contro costituenti
“self”, quali tessuti o organi trapiantati, sì da contribuire, talvolta in maniera decisiva, alla cosiddetta
“reazione di rigetto”.
La produzione di SCR da parte delle cellule può,
inoltre, subire un incremento notevole per effetto
di stimolazioni esterne. Infatti, oltre ai citati agenti
biologici – batteri ed altri microrganismi – anche
agenti fisici (es. radiazioni ionizzanti) o chimici (es.
inquinanti atmosferici), da soli o in combinazione tra
loro, possono indurre direttamente la generazione
di SCR o aumentarne la “fisiologica” produzione attraverso una specifica stimolazione metabolica (18).
Infine, giova ricordare che un aumento della
produzione di SCR può osservarsi tanto in situazioni
“fisiologiche”, come ad esempio dopo un intenso
sforzo muscolare, quanto nel corso di numerose
malattie.
In quest’ultimo caso, spesso, non è chiaro fino
a che punto i ROS siano la causa o l’effetto della
patologia considerata.
Questi aspetti, comunque, saranno approfonditi
nel terzo capitolo.
10
Capitolo 1. Specie chimiche reattive e radicali liberi
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