Caratterizzazione di proteine a livello atomico in cellule viventi.
Le attuali tecniche di biologia strutturale consentono di ottenere informazioni a livello atomico sulla
struttura di macromolecole biologiche, come le proteine, e sul meccanismo del loro funzionamento.
La caratterizzazione strutturale e funzionale è effettuata su campioni di biomolecole pure, in
soluzione acquosa (tramite la risonanza magnetica nucleare, NMR), in forma cristallina
(cristallografia a raggi X) o congelati in solidi amorfi (crio-microscopia elettronica).
Tuttavia, l’ambiente naturale in cui le molecole biologiche svolgono la loro funzione è
notevolmente diverso: le proteine citosoliche ad esempio si trovano in una sorta di gel in cui la
concentrazione proteica totale è stimata intorno ai 2-300 g/l, e altri compartimenti cellulari possono
raggiungere densità di macromolecole ancora maggiori. Inoltre altri fattori ambientali influiscono
sulla struttura e sulla dinamica a livello atomico, quali pH, forza ionica e potenziale redox, e sono
anch’essi dipendenti dal compartimento cellulare.
Recentemente, la tecnica di NMR in cellula (in-cell NMR) ha reso possibile ottenere informazioni a
livello atomico su proteine direttamente all’interno di cellule viventi. La tecnica è stata inizialmente
applicata a proteine overespresse in cellule di E. coli, considerate un buon modello per riprodurre le
condizioni del citoplasma eucariotico. Negli ultimi anni gli sforzi si sono concentrati sull’estensione
della tecnica a cellule di organismi superiori, rendendo possibile l’in-cell NMR su campioni di
cellule umane. Questo traguardo apre la strada allo studio non solo di come l’ambiente cellulare
influenzi la struttura delle proteine, ma di come le proteine interagiscano con partner specifici per
acquisire il fold, essere dirette a determinati organelli, legare cofattori e/o ioni metallici, e subire
altre modifiche co- e post-traduzionali che ne regolano l’attività all’interno della cellula.
Il progetto di ricerca da sviluppare nell’ambito di questo assegno di ricerca e’ dedicato allo studio a
livello atomico di processi funzionali, in particolare dei processi di maturazione, che coinvolgono
proteine all’interno di cellule viventi. A tale scopo diverse tecniche saranno integrate per ottenere
un quadro completo di varie specie proteiche in diversi momenti del processo di maturazione, e
della loro distribuzione all’interno della cellula. L’in-cell NMR applicata a cellule umane che
esprimono la proteina d’interesse permetterà di ottenere le informazioni a livello atomico. La
microscopia ottica confocale applicata alle stesse cellule, tramite l’uso di sonde fluorescenti,
permetterà di risalire alla distribuzione della proteina all’interno della cellula. Infine, altre tecniche
saranno integrate per risalire alla distribuzione intracellulare di cofattori metallici (microscopia di
fluorescenza a raggi X5, presso il sincrotrone Diamond Light Source, UK).
Il progetto si dedicherà anche all’analisi a livello atomico della composizione di biomolecole di
campioni cellulari in funzione del loro trattamento pre-analitico e conservazione in biobanca.
L’NMR consente infatti di ottenere informazioni sullo stato di conservazione e sulla vitalità dei
campioni di cellule in analisi. Questa capacità è importante non solo per verificare la sopravvivenza
e l’integrità delle cellule ai fini dell’esperimento in-cell, ma è utile di per sé per verificare la
stabilità di campioni di cellule prelevati a scopi biomedici, che vengono trattati per essere poi
conservati in biobanca. L’analisi della stabilità di questi campioni prima e dopo il trattamento
consentirà di mettere appunto procedure standardizzate che garantiscano il mantenimento delle
proprietà necessarie alle analisi biomediche.
La responsabile del progetto
Prof.ssa Paola Bruni
