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Struttura proteine-B
STRUTTURA PROTEINE_B
STRUTTURA PROTEINE_B..........................................................................1
Proteine fibrose ................................................................................................2
Alfa-cheratina....................................................................................................2
-cheratina è un dimero composto da 2 eliche avvolte.........................................2
Fibrina della seta...............................................................................................3
Collagene..........................................................................................................5
LA STRUTTURA TERZIARIA............................................................................................11
Proteine globulari: ..........................................................................................11
STRUTTURA
QUATERNARIA...........................................................................................14
COMPLESSI MULTIENZIMATICI .......................................................................................16
Triptofano-sintetasi..........................................................................................16
Enzimi bifunzionali ..........................................................................................16
Il complesso della piruvato deidrogenasi di E.coli................................................17
DNA polimerasi................................................................................ ................17
VANTAGGI
DELLE ATTIVITÀ MULTIPLE E DEI COMPLESSI MULTIENZIMATICI.........................................18
CRISTALLOGRAFIA
A RAGGI
X........................................................................................19
NMR.................................................................................................................21
STABILITÀ DELLE PROTEINE...................................................................24
1.forze elettrostatiche:.....................................................................................24
2.legami-H......................................................................................................24
3.forze idrofobiche...........................................................................................24
4.ponti disolfuro..............................................................................................24
EVOLUZIONE STRUTTURALE...................................................................30
Introni ed esoni...............................................................................................30
Evoluzione divergente di famiglie di proteine......................................................31
evoluzione convergente.......................................... .......................................... 32
Convergenza o divergenza?..............................................................................32
Evoluzione di proteine attraverso la fusione di frammenti genici..........................33
Il citocromo C è fra le proteine che più si sono conservate durante l'evoluzione....34
Struttura del citocromo C.................................................................................35
Struttura proteine-B
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Proteine fibrose
Proteine molto allungate in cui la struttura secondaria è il motivo
strutturale dominante.
Si trovano nei tendini, nella pelle nelle ossa con funzione
strutturale.
Alfa-cheratina
Nei mammiferi costituisce l’85% del contenuto delle cellule degli
strati superiori dell’epidermide.
α-cheratina è un dimero composto da 2 eliche avvolte
Struttura proteine-B
Fibrina della seta
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Struttura proteine-B
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Struttura proteine-B
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Collagene
È un componente della matrice extracellulare del tessuto
connettivo. È costituito da 3 catene polipeptidiche avvolte
Possiede degli Aa “insoliti”
Struttura proteine-B
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L’Hyp è sintetizzata dalla prolil-idrossilasi e necessita di acido
ascorbico.
Sequenza ripetuta: Gly-X-Y
Struttura proteine-B
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Struttura proteine-B
il collagene è organizzato in fibrille
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Struttura proteine-B
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Le fibrille di collagene sono legate covalentemente fra loro sia
intramolecolarmente (all’interno della stessa tripla elica) che
intermolecolarmente.
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Struttura proteine-B
La struttura terziaria
Proteine globulari:
Le proteine globulari contengono si ritrovano combinazione di elica e -strutture
Mioglobina : composta di solo -eliche
Struttura proteine-B
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Anidrasi carbonica : composta sia da -elica che da -strutture
Struttura proteine-B
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In una proteina globulare:
le catene laterali idrofobe si trovano prevalentemente
all’interno della proteina
i residui carichi + o – si trovano sulla superficie della
proteina
i residui polari possono trovarsi verso l’interno della
proteina (in questo caso inevitabilmente formano ponti-H
con altri residui polari)
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Struttura proteine-B
Struttura quaternaria
aspartato transcarbamilasi
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Struttura proteine-B
Complessi multienzimatici
Alcuni enzimi in special modo quelli coinvolti in step sequenziali
di una via biosintetica sono organizzati in aggregati fisici:
1.semplice associazione di 2 enzimi
2.complessi multienzimatici
3.grandi subunità come i ribosomi.
Triptofano-sintetasi
22 complesso non covalente:
indolo-3 glicero-fosfato
Indolo + serina
β2
α
indolo + gliceraldeide-3 P
triptofano
l'intermedio (indolo) NON è rilasciato in soluzione.
Enzimi bifunzionali
Fosfofruttocinasi 2/fruttosio 2,6 bisfosfatasi (enzima tandem)
1 sola catena polipeptidica 2 attività enzimatiche diverse
Struttura proteine-B
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Il complesso della piruvato deidrogenasi di E.coli
Complesso multienzimatico molto grande (grande quanto un
ribosoma !)
La piruvato deidrogenasi è composta di 3 catene polipeptidiche:
1.E1: piruvato decarbossilasi
2.E2: lipoato acetil-transferasi
3.E3 lipoamide deidrogenasi
il complesso è costituito da un core di 24 molecole del
complesso E2.
DNA polimerasi
È composta da una una singola catena polipeptidica e da 3 siti
attivi distinti:
1.DNA-polimerasi
2.esonucleasi 3' 5'
3.esonucleasi 5' 3'
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Vantaggi delle attività multiple e dei complessi
multienzimatici
1.aumento della capacità catalitica: diminuzione del tempo di
diffusione di un intermedio da un enzima ad un altro
2.incanalamento del substrato: direzionamento del substrato
verso uno specifico enzima piuttosto che permettere la
competizione con altri enzimi in soluzione
3.sequestro degli intermedi reattivi: protezione di intermedi
chimicamente instabili dal solvente acquoso
4.servicing: una subunità “passa” il substrato ad un'altra
subunità (es. ACP nella acido grasso sintasi dei mammiferi)
5. regolazione coordinata:
6. espressione coordinata:
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Struttura proteine-B
Cristallografia a raggi X
Cristallizzazione di una proteina difficoltà
Microscopio ottico: luce (4000-7000 Å) su un oggetto la luce
viene riflessa e rifratta e viene ricombinata da una serie di lenti
che danno un'immagine allargata dell'oggetto.
La risoluzione massima è ~ = alla λ della luce incidente.
Per poter vedere molecole occorre una λ <= 1 Å (raggi X)
Un cristallo di una proteina viene sottoposto ad un fascio di raggi
X monocromatico
si ottiene una diffrazione (le macchie
scure della lastra) corrispondente alla densità elettronica del
cristallo.
Struttura proteine-B
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Non ci sono lenti per i raggi X che ricostruiscano l'immagine
ricostruzione al computer (trasformazione di Fourier) per
ottenere un modello di struttura compatibile con la mappa di
densità elettronica.
La struttura di una proteina cristallizzata è uguale a quella in
soluzione ???
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Struttura proteine-B
NMR
Studio della struttura delle proteine in soluzione !!
Questo tipo di tecnica può “vedere “ la dinamica, i movimenti
delle proteine (non sono statiche, cristallizzate)
Alcuni nuclei (1H;
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C;
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N etc) possiedono un tipo di spin
nucleare che dà origine ad un segnale NMR.
Lo spin nucleare genera un momento magnetico (questi atomi si
comportano come magneti). Quando questoi atomi sono posti in
un forte campo magnetico statico si “allineano” nel campo in 2
possibili orientamenti:
1) parallelo (bassa energia)
2) antiparallelo (alta energia)
viene quindi applicata una radiazione con λ = onde radio i
nuclei passano
1
H ad una energia più elevata (risonanza)
assorbendo energia si ottiene uno spettro di assorbimento.
Struttura proteine-B
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La differenza di frequenza di risonanza fra i protoni (che,
teoricamente dovrebbe essere uguale) è dovuta all'ambiente in
cui si trova ciascun protone che scherma + o – il campo
magnetico esterno.
Una proteina contiene molte migliaia di protoni, quindi da uno
spettro monodimensionale è impossibile ricostruire la struttura
della proteina NMR bidimensionale !!
Struttura proteine-B
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La tecnica NMR consente di vedere la dinamica della proteina
Struttura proteine-B
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STABILITÀ DELLE PROTEINE
Le proteine sono entità che sono solo relativamente stabili in
condizioni fisiologiche.
L’energia libera per denaturarle è di appena 0.4 kJ/mol per
ogni Aa che compone la catena polipeptidica.
Per una proteina di 100 Aa = 40 kJ/mol
L’energia di un singolo legame-H è 20 kJ/mol
La struttura di una proteina è il risultato di un delicato
equilibrio fra forze contrapposte
1.forze elettrostatiche:
2.legami-H
3.forze idrofobiche
4.ponti disolfuro
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Struttura proteine-B
Forze elettrostatiche
le proteine sono molecole che possiedono molte cariche + e sulla superficie.
Energia di associazione fra 2 cariche (q1; q2) separate da una
distanza r (D = cost dielettrica del mezzo=1 nel vuoto ed
aumenta con la polarità del mezzo: acqua D=80):
kq1 q 2
U=
Dr
1) interazioni ioniche fra 2 residui con carica opposta (ponte
salino; coppia ionica)
di solito in ambiente acquoso le cariche sono solvatate (e
quindi schermate) quindi questo tipo di interazione porta un
piccolissimo contributo alla stabilità della proteina.
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Struttura proteine-B
2)interazioni dipolo-dipolo (forze di van der Waals)
questo tipo di interazioni elettrostatiche sono di per sè molto
deboli
(~4
kJ/mol;
leg
covalente
400
kJ/mol)
ma
ciononostante influenzano in modo significativo il foldind delle
proteine perchè:
1)sono molto numerose
2)nel
core
della proteine c'è una costante dielettrica bassa
(ambiente anidro) aumento interazioni elettrostatiche.
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Struttura proteine-B
3)legami-H
legame elettrostatico direzionale relativamente debole (12-29
kJ/mol)
i legami-H interni portano un grande contributo al mantenimento
odella
corretta
conformazione
configurazioni beta)
della
proteina
(alfa-eliche
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Struttura proteine-B
4)attrazioni idrofobiche
forze idrofobiche: una sostanza idrofoba tende a minimizzare la
superficie di contatto con il solvente polare (acqua)
le molecole di acqua tendono a disporsi con regolatità intorno
alla superficie idrofoba
aumento di ordine = diminuzione di
entropia
disordine)
(misura
del
situazione
energicamente
sfavorevole
Il maggior contributo alla stabilità delle proteine è dato dalle
INTERAZIONI IDROFOBICHE. (gli Aa idrofobici stanno all'interno
della proteina ovvero in un ambiente anidro).
Struttura proteine-B
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Profilo di idrofobicità di una proteina
5)ponti disolfuro
sono presenti nelle proteine extracellulari. Nel citoplasma c'è un
potenziale di riduzione piuttosto elevato (le cisteine si trovano
allo stato ridotto: -SH)
Struttura proteine-B
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EVOLUZIONE STRUTTURALE
4000 proteine diverse in E.coli, 6000 proteine nel lievito molte di
più negli organismi superiori in che modo si è generata
questa diversità ??
Introni ed esoni
i geni degli eucarioti sono discontinui.
La variabilità dei prodotti genici può derivare da splicing
alternativo.
•
Molti isoenzimi
•
anticorpi
Struttura proteine-B
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Evoluzione divergente di famiglie di proteine
Le serino-proteasi sono una famiglia di enzimi che hanno una
struttura 3D molto simile e un pressoché identico meccanismo di
reazione.
La differenza fra questi enzimi è la specificità di substrato:
●
La tripsina taglia i peptidi in corrispondenza di Lys e Arg
●
La chimotripsina taglia i peptidi in corrispondenza di Trp, Phe,
Tyr
●
l'elastasi taglia i peptidi in corrispondenza di piccoli Aa
idrofobici (Ala)
Struttura proteine-B
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Le serino-proteasi di mammifero rappresentano un caso tipico di
evoluzione divergente (derivano tutte da un progenitore
comune).
L'evoluzione divergente si è avuta per duplicazione genica e
successive mutazioni puntiformi.
La duplicazione genica permette al gene di svincolarsi dalla
pressione selettiva e quindi può permettere ad una delle due
copie di poter mutare e quindi evolversi
evoluzione convergente
la serino-proteasi del batterio
è
diversa come struttura 3D dalle serino-proteasi di mammifero
ma ha la stessa specificità di substrato e lo stesso
meccanismo catalitico.
Organismi diversi partendo da una differente struttura 3D hanno
evoluto proteine con una stessa funzione.
Convergenza o divergenza?
Si pensa ad una evoluzione divergente se la sequenza genica e
la struttura delle proteine sono simili.
Struttura proteine-B
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Evoluzione di proteine attraverso la fusione di
frammenti genici
Gli esoni possono corrispondere ad unità funzionali delle proteine
(DOMINI).
Nuove proteine (con nuove funzioni) possono risultare dalla
ricombinazione di diversi esoni.
Un fenomeno correlato è la ripetizione dello stesso dominio in
una proteina (es domini ripetuti negli anticorpi e nella rodanasi)
La rodanasi presenta 2 distinti domini con una struttura molto
simile. Probabilmente si è evoluta per duplicazione genica di un
dominio e successiva fusione dei 2 geni risultanti.
Struttura proteine-B
Il citocromo C è fra le proteine che più si sono
conservate durante l'evoluzione
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Struttura proteine-B
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Struttura del citocromo C
Sono particolarmente conservati durante l'evoluzione quei residui
che servono per il legame del gruppo eme !!
