PRODA
Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare
Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Informazioni per la diagnosi molecolare di
sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita
test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2
(Connessina 26) al locus DFNB1sul braccio lungo del cromosoma 13.
Le ipoacusie interessano circa il 4% della popolazione di età inferiore ai 45anni e comprendono un
vasto spettro di manifestazioni cliniche. Oltre il 60% delle sordità è di origine genetica, la rimanente
parte è dovuta a cause di natura ambientale (infezioni durante la gravidanza, traumi, farmaci, etc.)
Delle sordità di origine genetica il 30% fanno parte di una condizione sindromica (la perdita di
udito si associa ad altri sintomi e/o manifestazioni cliniche) ad eredità mendeliana o mitocondriale
(sindrome di Alport, Norie, Usher, Waardenburg, etc.)
Il 70% delle sordità di origine genetica sono forme non sindromiche (la perdita di udito è l’unico
sintomo presente) ad eredità mendeliana o mitocondriale. Sono caratterizzate da una elevata
eterogeneità genetica, cioè dalla presenza di geni diversi in grado, una volta mutati di dare origine a
quadri clinici del tutto sovrapponibili, e possono essere suddivise, in base alle modalità di
trasmissione, come di seguito:
•
•
•
•
Recessive (circa 80% dei casi)
Dominanti (circa il 20% dei casi)
X-linked (circa l’1% dei casi)
Mitocondriali (circa l’1% dei casi)
Allo stato attuale sono stati identificati 30 loci per le forme recessive, 39 loci per le forme
dominanti e 6 loci per le forme trasmesse come carattere legato al cromosoma X. Solo alcuni dei
corrispondenti geni sono stati identificati (20 geni per l’esattezza) e diversi tra questi appartengono
ad alcune famiglie di geni codificanti per proteine coinvolte nei meccanismi della contrazione delle
cellule ciliate.
Le sordità recessive, il locus DFNB1 e la mutazione 35delG
La maggior parte delle famiglie di origine caucasoide in cui la sordità si trasmette come carattere
autosomico recessivo sono associate al locus DFNB1 (circa l’80%, ma in Italia e Spagna si arriva
anche al 90% dei casi) che si trova sul braccio lungo del cromosoma 13 (13q11). Il gene coinvolto
nel determinare la sordità codifica per la proteina connessina 26 (CX26) detta anche GJB2. Le
connessine sono una famiglia di proteine presenti sulla membrana plasmatica che formano dei
canali necessari per gli scambi e le comunicazioni tra le cellule. La ipoacusia presente in queste
famiglie è di tipo neurosensoriale bilaterale profondo ed è presente alla nascita (congenita).
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Sono state descritte diverse mutazioni nel gene GJB2, ma nelle popolazioni caucasoidi, nella
maggior parte dei casi associati al locus DFNB1, si osserva una sola mutazione, chiamata 35delG
(perdita di una guanina in posizione 35). La mutazione 35delG si ritrova nella maggior parte dei
soggetti affetti da sordità ereditaria in Italia ed in tutto il bacino del Mediterraneo ed è in grado di
spiegare il 50% di tutte le sordità. Se dopo una accurata valutazione anamnestica si escludono i
soggetti con deficit uditivo da cause iatrogene ed i casi in cui non vi è una chiara trasmissione
ereditaria di tipo recessivo la mutazione 35delG caratterizza più del 70% di tutti i casi di sordità.
Non va dimenticato che il 40% dei casi sporadici è dovuto alla presenza di questa mutazione
(Estivill et al.,1998).
Una così elevata frequenza di soggetti affetti con mutazione 35delG in omozigosi si spiega con un
elevato numero di portatori sani di questa mutazione nella popolazione generale. La frequenza della
mutazione 35delG in Italia è elevata (1/35 individui) come anche in molte altre nazioni del bacino
del mediterraneo (frequenze oscillanti tra 1/25 e 1/50) (Gasparini et al.,2000).
La diagnosi molecolare delle sordità genetiche
La diagnosi molecolare delle sordità genetiche, nel nostro Laboratorio, prevede (come da linee
guida per l’inquadramento diagnostico delle ipoacusie genetiche- gruppo di lavoro SIGU) una
consulenza genetica che precede il test molecolare (raccolta anamnesi familiare, illustrazione delle
finalità e dei limiti dei test dato l’elevato numero dei geni associati a sordità, etc.) ed uno studio
familiare esteso; una volta escluse le cause iatrogene di sordità è opportuno sottoporre tutti i
soggetti con problemi di ipoacusia all’esame molecolare nei geni noti per la identificazione della
forma di sordità. Si esegue l’analisi del gene GJB2 mediante tecnica di sequenziamento diretto. Se
viene evidenziata la mutazione 35delG su un sola copia del gene GJB2 viene effettuato un esame
sull’intero gene per identificare una eventuale II° mutazione. Se non c’è omozigosi o eterozigosi
composta GJB2 viene studiata la regione promotrice di GJB2 ed il gene GJB6 (connessina 30) allo
scopo di escludere forme di doppia eterozigosi (digenia). Se l’analisi molecolare ai geni GJB2 e
GJB6 risulta negativa è consigliabile l’esecuzione del test specifico per la mutazione mitocondriale
A1555G (frequenza nella popolazione 1/1000). Una volta identificato sugli affetti il gene coinvolto
e la relativa mutazione si rende disponibile un test molecolare per ogni componente del nucleo
familiare (ed anche un test diagnostico prenatale); questo può portare a definire con precisione il
rischio riproduttivo in ciascun soggetto della famiglia.
Test di screening sulla coppia e diagnosi prenatale
In alcuni casi, ove richiesto espressamente, può essere effettuata la identificazione della mutazione
35delG come test di sreening sulla coppia per identificare lo stato di portatore (come previsto dalle
stesse linee guida per l’inquadramento diagnostico delle ipoacusie genetiche -gruppo di lavoro
SIGU); in diagnosi prenatale il test sul feto è effettuato solo se presente lo stato di portatore su uno
o entrambi i genitori; in questi casi, se il feto risulta negativo alla mutazione 35delG, può essere
esclusa sul feto la sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita associata al locus
DFNB1(GJB2) oppure non essere esclusa se il feto è portatore della mutazione 35delG di un
genitore.
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A tal proposito è importante sottolineare che:
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se entrambi i genitori sono negativi al test per la mutazione 35delG questo non esclude che
possano essere presenti altre mutazioni rare al medesimo locus (DFNB1 o gene GJB2) non
evidenziabili con questo test o mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di
sordità non sindromica.
se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG e l’altro negativo al test per la
mutazione 35delG viene effettuato un test ulteriore per la ricerca di 66 mutazioni sul genitore
non portatore della mutazione 35delG.
il test sul feto è effettuato solo se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG (o
altra mutazione); questo test può escludere (feto negativo alla mutazione 35delG) la forma di
sordita neurosensolriale bilaterale profonda associata al locus DFNB1 (GJB2) nel 50% dei
casi o non escluderla nell’altro 50% dei casi (se il feto è portatore della mutazione 35delG)
poiché potrebbe portare una II° mutazione rara al medesimo locus (GJB2) presente in uno dei
genitori e non evidenziabile anche con il test per la ricerca di ulteriori 66 mutazioni (nei casi
di non esclusione non è possibile avere una definizione accurata del rischio di malattia nel
feto). In ogni caso il test sul feto effettuato non è in grado di identificare mutazioni in loci
diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica.
se entrambi i genitori sono positivi al test per la mutazione 35delG o altra mutazione al
medesimo locus (entrambi portatori) il rischio di avere un figlio affetto da sordità
neurosensoriale bilaterale profondo congenito è pari al 25% (cioè ad una probabilità su 4). In
questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel
feto.
Materiali e metodi utilizzati
L’analisi per la ricerca della mutazione 35delG viene condotta inizialmente effettuando una
reazione di amplificazione molecolare del DNA, conosciuta come PCR (Polymerase Chain
Reaction), di una parte della regione codificante del gene GJB2 (CX26 o Connessina 26; locus
DFNB1 sul braccio lungo del cromosoma 13) e successiva digestione del prodotto di PCR con
l’enzima di restrizione BseLI (BsiYI) (Storm et al.,1999). L’eventuale analisi per la ricerca di
ulteriori 66 mutazioni nel gene viene condotta effettuando una reazione di amplificazione
molecolare del DNA di una parte della regione codificante e non codificante del gene GJB2
(Zelante et al.,1997 mod). Il prodotto di PCR così ottenuto, dopo purificazione, viene sottoposto ad
analisi automatizzata mediante l’impiego di un sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente
(Cycle Sequencing su ABI 3730).
Referenti per l’analisi genetica di sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo
congenita
Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l’analisi
molecolare sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l’eventuale test molecolare sul feto per
la sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita associata al locus DFNB1, sono
precedute da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica Medica, che ha la
finalità di trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a comprenderne il
significato e le implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso informato degli
interessati.
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L’analisi molecolare è effettuata presso l’Istituto di Diagnostica Clinica PRODA Sezione
Citogenetica e Genetica Molecolare.
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Istituto di Diagnostica Clinica
Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare
Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini
Specialista in Genetica Medica
Consenso informato all’indagine genetica per
sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita
test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2
(connessina 26) al locus DFNB1sul braccio lungo del cromosoma 13
Ho preso visione delle informazioni allegate. Avendo compreso il significato e le implicazioni
di queste procedure, chiedo di sottopormi alle seguente indagine genetica:
test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2
(Connessina 26) al locus DFNB1 sul braccio lungo del cromosoma 13.
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Sono consapevole che il test sul feto sarà effettuato solo se presente lo stato di portatore su
uno o entrambi i genitori; in questi casi, se il feto risulta negativo alla mutazione 35delG,
può essere esclusa sul feto la sordita’ di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita
associata al locus DFNB1(GJB2) oppure non essere esclusa se il feto porta la mutazione
35delG di un genitore.
Sono inoltre consapevole che:
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se entrambi i genitori sono negativi al test per la mutazione 35delG questo non esclude che
possano essere presenti altre mutazioni rare al medesimo locus (DFNB1 o gene GJB2) non
evidenziabili con questo test o mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di
sordità non sindromica.
se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG e l’altro negativo al test per la
mutazione 35delG viene effettuato un test ulteriore per la ricerca di 66 mutazioni sul
genitore non portatore della mutazione 35delG
il test sul feto è effettuato solo se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG (o
altra mutazione); questo test può escludere (feto negativo alla mutazione 35delG) la forma
di sordita neurosensolriale bilaterale profonda associata al locus DFNB1 (GJB2) nel 50%
dei casi o non escluderla nell’altro 50% dei casi (se il feto è portatore della mutazione
35delG) poiché potrebbe portare una II° mutazione rara al medesimo locus (GJB2) presente
in uno dei genitori e non evidenziabile anche con il test per la ricerca di ulteriori 66
mutazioni (nei casi di non esclusione non è possibile avere una definizione accurata del
rischio di malattia nel feto). In ogni caso il test sul feto effettuato non è in grado di
identificare mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica.
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se entrambi i genitori sono positivi al test per la mutazione 35delG o ad un'altra mutazione
al medesimo locus (entrambi portatori) il rischio di avere un figlio affetto da sordità
neurosensoriale bilaterale profondo congenito è pari al 25% (cioè ad una probabilità su 4).
In questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia
nel feto.
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l’analisi per la ricerca della mutazione 35delG viene condotta inizialmente effettuando una
reazione di amplificazione molecolare del DNA (PCR) di una parte del gene GJB2 e
successiva digestione del prodotto di PCR con l’enzima di restrizione BseLI (BsiYI; Storm
et al.,1999). La eventuale ricerca delle 66 mutazioni conosciute nel gene GJB2, sul genitore
non portatore della mutazione 35delG, viene condotta effettuando una reazione di
amplificazione molecolare di una parte della regione codificante e non codificante del gene
GJB2 e successiva analisi per sequenziamento automatico del prodotto di PCR purificato
(Cycle Sequencing su ABI 3730; Zelante et al.,1997).
La mia richiesta di sottopormi ai test è completamente volontaria.
Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al
Laboratorio.
Sono consapevole che raramente queste analisi possono fornire un risultato errato ma che,
comunque, la probabilità di un errore diagnostico è inferiore all’1%.
Dati anagrafici del paziente
Cognome:
Nome:
Data e luogo di nascita:
Indirizzo:
Recapito telefonico:
e-mail:
Roma,
Firma del paziente
Firma del Medico che ha raccolto il consenso
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