VALUTAZIONE DELLA
TOSSICITA’ DEI FARMACI
SPERIMENTAZIONE PRECLINICA
FARMACOCINETICA
(Assorbimento,
distribuzione, metabolismo, escrezione)
TOSSICITA’ ACUTA, SUBCRONICA E CRONICA
STUDI TOSSICOLOGICI SULLA RIPRODUZIONE
STUDI DI CANCEROGENESI
STUDI DI MUTAGENESI
TOSSICITA’
riduzione di funzioni o ciclo
vitale di un organismo
acuta
altre tossicità
subcronica
cronica
dose-risposta quantale aumento incidenza effetti a
una determinata dose
TOSSICITA’ ACUTA
IT =
DL50
ED50
IT
maggiore sicurezza
del farmaco
gli effetti acuti non sono comunque limitati alla sola letalità
tossicità
-
+
è possibile
determinare LD50
diverse per
sostanze che sono
assorbite
attraverso vie
diverse
TOSSICITA’ ACUTA
la curva dose-risposta può essere
trasformata in una retta per estrapolare
anche altri parametri di tossicità come la
DL10 o la DL100.
Tuttavia bisogna
considerare i limiti connessi con le
estrapolazioni matematiche
la dose massima di sostanza deve
mantenersi entro limiti regolamentati per
evitare effetti aspecifici, e simulare il più
possibile l’esposizione umana
STUDI DI TOSSICITA’-PRINCIPI GENERALI
Definire la dose minima che produce effetti tossici e la dose
massima che non induce alcun effetto, diretto o indiretto
regolamentazione europea
Definire la relazione tra dose terapeutica e dose tossica
rapporto quantitativo
Individuare quale struttura cellulare, organo o sistema sia il
bersaglio della tossicità differenziare tra diretta o indiretta
Definire le caratteristiche dell’effetto tossico determinato dalla
molecola o dai suoi metaboliti possibili meccanismi
Stabilire la reversibilità o meno degli effetti tossici osservati
a breve e/o lungo termine
SPERIMENTAZIONE PRECLINICA
PROVE DI TOSSICITA’
COSA DEVONO EVIDENZIARE
soglia di tossicità
alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche dovute al
farmaco
relazione tra effetti tossici e dosi
COME SI ESEGUONO
esame di mortalità, accrescimento e modificazioni del
comportamento unito a valutazioni autoptiche e istologiche
TOSSICITA’ ACUTA
Somministrazione unica (acuta) del principio attivo
su due o più specie di mammiferi (in genere scelte
tra ratto, topo e coniglio)
Almeno due diverse vie di somministrazione (nel
caso dei roditori), una delle quali identica a quella
proposta nell’uomo, mentre l’altra deve garantire
l’assorbimento sistemico del farmaco
TOSSICITA’ ACUTA
periodo di osservazione adeguato a evidenziare
danni ai tessuti e agli organi e/o il ritorno delle
condizioni dell’animale alla norma. NON E’ MAI
INFERIORE AI 7 GIORNI
prove devono fornire dati il più possibile chiari
sulla relazione dose/effetto e dose/mortalità per
consentire il calcolo della DL50
esame anatomo-istopatologico deve essere
effettuato al termine dell’osservazione (e/o sugli
animali deceduti)
STUDI DI TOSSICITA’ ACUTA
ESEMPIO DI PROTOCOLLO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Animali adulti standardizzazione dei risultati
Entrambi i sessi compensazione differenze ormonali
Specie animali diverse metabolismo
Numero minimo 5 animali variabile ma mai inferiore
Dose pilota basata sulla DL50 deve dare effetti specifici
Somministrazione mantenere un volume costante
Scelta del solvente somministrato anche ai controlli
7 giorni osservazione variabile ma mai inferiore
Studio autoptico degli animali deceduti
prolungando il periodo di osservazione fino a circa 14 giorni si possono
effettuare valutazioni di tossicità subacuta
STUDI DI TOSSICITA’ ACUTA- SINTOMI COMUNI
- respiratori (dispnea, apnea, cianosi, tachipnea, edema
polmonare)
- cardiovascolari (variazioni della frequenza, extrasistoli,
variazioni
dell’ECG,
ipotensione,
ipertensione,
vasocostrizione o vasodilatazione cutanea)
- nervosi (convulsioni, variazioni del tono muscolare,
variazioni della motilità, sonno, analgesia, piloerezione,
variazioni delle funzioni motorie superiori)
- cutanei (eritema, edema, alterazioni del pelo)
- gastroenterici
intestinali)
(vomito,
diarrea,
emorragie
gastro-
nel caso dei farmaci gli effetti tossici sono in genere correlati all’effetto
terapeutico
TOSSICITA’ SUBCRONICA
integra gli studi di tossicità acuta e considera una
frazione significativa del ciclo vitale dell’animale
(in genere il 20%)
almeno 3 dosi di farmaci, scelte sulla base degli studi
di tossicità acuta
almeno due specie di mammiferi, di cui una non
appartenente ai roditori
TOSSICITA’ SUBCRONICA
elevata: deve essere associata a
una mortalità non superiore al 10%
degli animali
DOSI
intermedia: calcolata come media
fra la dose elevata e la minore
minore permette di fissare il margine
di tolleranza attraverso la valutazione
dell’effetto farmacologico
questi studi permettono anche di calcolare le dosi minime e massime a cui
si osservano effetti tossici
TOSSICITA’ SUBCRONICA
la
somministrazione
deve
garantire
uniformità della dose somministrata durante
tutto il trattamento
deve essere attentamente considerato il
fenomeno della bioaccumulazione quando
si stimano le dosi e si valutano gli effetti
STUDI DI TOSSICITA’SUBCRONICA
ESEMPIO DI PROTOCOLLO
•
•
•
•
•
•
•
Animali adulti standardizzazione dei risultati
Entrambi i sessi compensazione differenze ormonali
Specie animali diverse tassativamente un non-roditore
Somministrazione intragastrica o negli alimenti
Numero minimo 10 animali variabile ma mai inferiore
3 livelli di dose
Valutazione del ruolo della bioaccumulazione
I conigli non sono roditori
STUDI DI TOSSICITA’ SUBCRONICA
ESEMPIO DI ESAMI
-Esame delle urine (chetonuria, porfirinuria, emoglobinuria,
ematuria, glicosuria, pressione osmotica, cristalli, cellule di
sfaldamento, pH).
-Chimica clinica (livelli plasmatici di bilirubina, creatina e creatinina,
colinesterasi, acidi grassi, colesterolo, LDLP e HDLP, glicemia,
azotemia, elettroliti, acido urico, proteine totali e frazionate,
immunoglobuline, marcatori enzimatici di funzioni di organo (creatinfosfochinasi, colinesterasi, lattico deidrogenasi, fosfatasi alcaline ed
acide, transaminasi, amilasi).
-Ematologia ematocrito, emoglobina, conte di GR e GB, con
eventuale formula leucocitaria, piastrine, misure di coagulazione.
L’interpretazione dei risultati ottenuti in questi studi è molto
complessa e deve considerare tutte le variabili valutate e le
loro interazioni
TOSSICITA’ CRONICA
copre la quasi totalità della vita dell’animale (sopra i 3
mesi nel roditore)
la scelta del tipo di protocollo e della dose da
impiegare devono tenere presente il peggioramento
delle condizioni dell’animale durante il trattamento
la scelta della dose si può avvalere del fattore di
cronicità
TOSSICITA’ CRONICA
FATTORE DI CRONICITA’
giorno 0
giorno 90
valutazione quotidiana di DL50
se
DL50
decresce
sensibilmente
progressivamente
si
è
in
presenza
bioaccumulazione della sostanza da valutare
e
di
TOSSICITA’ CRONICA
elevata: calcolata in genere come
dose associata ad una perdita di
peso del 10% in 3 mesi. E’ detta
anche MDT (Massima Dose
Tollerata)
DOSI
intermedia: calcolata come media
fra la dose elevata e la minore
minore dose non associata a effetti
tossici. Dovrebbe essere da 2 a 10
volte superiore a quella proposta
per la terapia
TOSSICITA’ CRONICA
i protocolli sono simili a quelli utilizzati per la
tossicità acuta e subcronica
i parametri vitali devono essere controllati a
intervalli
regolari
lungo
tutto
il
corso
dell’esperimento
può essere applicata non solo ai principi attivi dei
farmaci ma anche agli additivi; in questo caso la
dose si calcola sulla base dell’esposizione
presunta di esposizione giornaliera
TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA
riguarda i processi fisiologici pertinenti alla
sfera riproduttiva
• riduzione della fertilità
• morte fetale
• malformazioni di varia gravità
TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA
gli animali preferiti sono il topo e il ratto, ma si può usare anche
il coniglio
• Modifiche della fertilità o procreazione anormale
dovuta a danni dei gameti maschili e/o femminili
• Interferenza con le fasi di pre-impianto e impianto
dell’embrione e del suo sviluppo
• Effetti tossici di vario tipo sull’embrione
• Effetti tossici di vario tipo sul feto
TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA
STUDI DI FERTILITA’
maschi
accoppiamento con femmine sane e
valutazione del tasso di natalità e
delle caratteristiche del liquido
seminale
femmine
accoppiamento con riproduttori sani
femmine e valutazione del tasso di
natalità e delle caratteristiche delle
nidiate
TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA
STUDI EMBRIONALI E PERINATALI
FASE I pre-impianto. 14 giorni somministrazione
(coprire ovulazione). Morte fetale e aborto.
FASE II organogenesi. In genere i primi tre quarti della
gravidanza. Malformazioni, effetti teratogeni
FASE III embrionale e neonatale. Ultimo quarto della
gravidanza e allattamento. Ritardo crescita, deficits
funzionali
TOSSICITA’ RIPRODUTTIVA
PROTOCOLLO
•Pubertà
•Inizia il trattamento che prosegue per 100 giorni
•Accoppiamento e produzione della prima nidiata (F1)
•Dopo 50 giorni inizia il trattamento degli F1 che
prosegue per 120 giorni. Si accoppiano gli F1
producendo gli F2
•Svezzamento degli F2, conta, misura del peso,
uccisione, necroscopia e istopatologia
i protocolli specifici variano a seconda dell’ente regolatore, ma
la durata delle procedure è in genere lunga
STUDI DI CANCEROGENICITA’
manifestazione di tumori indotti o aumento di frequenza
di tumori spontanei spesso combinati a cronici
Due specie animali il ratto è tra gli animali preferiti
Via di somministrazione analoga all’uomo, lontana dal sito
Documentazione assorbimento
Somministrazioni giornaliere trattamento prolungato
Gruppi sperimentali devono essere numerosi
Almeno tre dosaggi possono essere ottenuti da altri studi
si basano sull’assunzione che tutte le sostanze cancerogene per
gli animali lo siano anche per l’uomo
STUDI DI CANCEROGENICITA’
massima:
dovrebbe
essere
cancerogena ma non associata ad
altre manifestazioni tossiche
DOSI
intermedia: calcolata come media
fra la dose elevata e la minore
minima: dose non associata a effetti
cancerogeni. Dovrebbe essere da 2
a 10 volte superiore a quella
proposta per la terapia
STUDI DI CANCEROGENICITA’
RICHIESTI PER NUOVE MOLECOLE, IN PARTICOLARE
PER:
molecole di una classe nota per possedere effetti
cancerogeni rilevanti anche per l’uomo;
relazione struttura attività che suggerisce un rischio
cancerogeno
evidenza di lesioni neoplastiche negli studi di tossicità
ripetuta
ritenzione a lungo termine della molecola o suoi metaboliti,
in determinati organi
evidenze di positività nei test di mutagenesi
STUDI DI CANCEROGENICITA’
Frequenza nei controlli (%)
Frequenza nei trattati(%)
60
30
20
10
10
17
65
241
-
5
13
35
76
464
1
10
27
46
114
Dimensioni del campione sperimentale richieste per ottenere differenze
significative con potenza statistica del 95%. Se l’incidenza spontanea dei
tumori è del 5% e ci si attende un incremento fino al 10% serviranno 464
animali per dose
è necessario utilizzare alte dosi di farmaco per cercare di ridurre al
minimo necessario il numero di animali
STUDI DI MUTAGENESI
si effettuano in vitro e in vivo
Induzione mutazioni geniche, danni cromosomici e/o
genomici, danni primari al DNA.
Completano studi di cancerogenesi e di teratogenesi
STUDI DI MUTAGENESI
almeno:
Un test di mutazione genica sui batteri
Un test di mutazione genica in un sistema eucariotico in
presenza o meno di induttori del metabolismo
Un test di aberrazioni cromosomiche in colture di cellule di
mammifero
Un test in vivo di danno genetico (i più convalidati sono quelli a
livello cromosomico, come il Mouse Spot Test)
STUDI SUPPLEMENTARI
Studi di tollerabilità locale: sono richiesti prima della
sperimentazione clinica se, la via di somministrazione topica è
rilevante per l’impiego nell’uomo o se si ritiene che la via
endovenosa possa determinare lesioni
•Prove di immunogenicità: sono effettuate per valutare la
capacità immunogenica e allergizzante di un farmaco, oltre
alla sua eventuale interferenza con il sistema immunitario
•Prove di pediatria: se si prevede utilizzo in bambini, può
essere necessario eseguire studi in ratti neonati. Normalmente,
si preferisce avviare studi pediatrici, solo se in possesso di
consistenti risultati nell’adulto e in presenza dei test completi di
tossicità della riproduzione, mutagenesi e tossicità ripetuta
