Valutazione della tossicità
dei farmaci
IT =
IT
DL50
ED50
maggiore sicurezza
del farmaco
Studi di tossicologia
• Definire la minima dose che produce effetti
tossici e la massima che non induce alcun effetto,
diretto od indiretto
• Definire la relazione tra dose terapeutica e dose
tossica
• Individuare quale struttura cellulare, organo o
sistema sia il bersaglio della tossicità
• Definire le caratteristiche dell’effetto tossico
determinato dalla molecola o dai suoi metaboliti
• Stabilire la reversibilità o meno degli effetti
tossici osservati
Sperimentazione preclinica
• FARMACOCINETICA
(Assorbimento, distribuzione, metabolismo,
escrezione)
• TOSSICITA’ SUBACUTA E CRONICA
• STUDI TOSSICOLOGICI SULLA
RIPRODUZIONE
Sperimentazione preclinica
PROVE DI TOSSICITA’
Le prove di tossicità per somministrazioni ripetute,
subacuta (breve termine) e cronica (lungo termine)
devono mettere in evidenza
- la soglia di tossicità,
- le alterazioni funzionali e/o anatomo-patologiche
conseguenti alla somministrazione ripetuta del farmaco
- le condizioni della comparsa di alterazioni in funzione
della posologia.
La valutazione degli effetti tossici viene effettuata
esaminando mortalità, comportamento, accrescimento,
crasi ematica, prove funzionali a carico dei diversi organi
(cuore, fegato, rene, milza ecc.), in base ai reperti
autoptici e esami istologici.
Studi di tossicità acuta
• Somministrazione unica (acuta) del principio
attivo su due o più specie di mammiferi (ratto,
topo, coniglio)
• Due diverse vie di somministrazione (nel caso dei
roditori), una delle quali identica a quella proposta
nell’uomo,
mentre
l’altra
deve
garantire
l’assorbimento sistemico del farmaco
Studi di tossicità acuta
• Il periodo di osservazione deve essere adeguato
a mettere in luce i danni ai tessuti e agli organi,
oppure il ritorno delle condizioni dell’animale alla
norma;
durata 14 giorni, mai inferiore a 7 giorni e può
proseguire per tutto il tempo in cui persistono i
segni di tossicità
• Le prove devono fornire dati sulla relazione
dose/effetto e dose/mortalità;
procedere alla valutazione quantitativa della DL50
• Esame anatomo-istopatologico degli organi
Tossicità acuta
•
•
•
•
•
•
•
Animali adulti
Entrambi i sessi
Specie animali diverse
Numero minimo 5 animali
Dose pilota
7 giorni osservazione
Studio autoptico degli animali deceduti
I sintomi più comunemente descritti
esperimenti di tossicità acuta sono:
negli
-respiratori (dispnea, apnea, cianosi, tachipnea, edema
polmonare)
-cardiovascolari (variazioni della frequenza, extrasistoli,
variazioni
dell’ECG,
ipotensione,
ipertensione,
vasocostrizione o vasodilatazione cutanea)
-nevrosi (convulsioni, variazioni del tono muscolare,
variazioni della motilità, sonno, analgesia, piloerezione,
variazioni delle funzioni motorie superiori)
-cutanei (eritema, edema, alterazioni del pelo)
-gastroenterici
intestinali)
(vomito,
diarrea,
emorragie
gastro-
TOSSICITA’ SUBACUTA
Prove di tossicità subacuta (30 e 90 giorni).
Le sperimentazioni vengono effettuate:
• somministrando tre dosi a gruppi diversi di
animali (nel caso dei roditori, 20 animali per
gruppo, di cui 10 maschi e 10 femmine
• utilizzando due specie di mammiferi (ratto,
cane, maiale) di cui una di roditori
TOSSICITA’ SUBACUTA
Tre livelli di dose:
La più elevata deve far comparire effetti
tossici d’organo o mortalità in non più
del 10% degli animali;
La minore permette di fissare il margine
di tolleranza (effetto farmacologico);
La intermedia è la media fra la dose
maggiore e la minore;
Tossicità subcronica
•
•
•
•
•
Animali adulti
Entrambi i sessi
Specie animali diverse
Numero minimo 10 animali
3 livelli di dose (dose più alta non deve
dare più del 10% di mortalità)
• Conoscere emivita sostanza
(bioaccumulazione)
Controlli tossicità subcronica
-Esame delle urine (chetonuria, porfirinuria, emoglobinuria,
ematuria, glicosuria, pressione osmotica, cristalli, cellule di
sfaldamento, pH).
-Chimica clinica (livelli plasmatici di bilirubina, creatina e
creatinina, colinesterasi, acidi grassi, colesterolo, LDLP e
HDLP, glicemia, azotemia, elettroliti, acido urico, proteine
totali e frazionate, immunoglobuline, marcatori enzimatici
di funzioni di organo (creatin-fosfochinasi, colinesterasi,
lattico deidrogenasi, fosfatasi alcaline ed acide,
transaminasi, amilasi).
-Ematologia ematocrito, emoglobina, conte di GR e GB, con
eventuale formula leucocitaria, piastrine, misure di
coagulazione.
Tossicità cronica
• Studi di tossicità cronica (3 - 12 mesi)
• Tre livelli di dose:
• La maggiore deve dare segni di tossicità
• La minore ben tollerata e se possibile, da 2 a
10 volte superiore a quella giornaliera
prevista per l’uso terapeutico,
• La intermedia sia la minima dose in grado di
indurre il primo chiaro effetto tossico.
Tossicità riproduttiva
• Fertilità
• Morte fetale
• Malformazioni
Esame della funzione riproduttiva
Deve mettere in rilievo su due specie animali
(ratti e conigli):
• Modifiche della fertilità o procreazione
anormale dovuta a danni dei gameti maschili
e/o femminili
• Interferenza con le fasi di pre-impianto e
impianto del feto e del suo sviluppo
• Effetti tossici sull’embrione
• Effetti tossici sul feto
• Studi di fertilità: (somministrazione durante e dopo
accoppiamento) valutazione nel maschio e nella femmina,
della funzione riproduttiva (funzionalità delle gonadi,
ciclo estrale, comportamento di accoppiamento, indici di
fertilità, analisi dei primi stadi della gestazione);
• Studi di teratogenesi: somministrazione alla madre
durante il periodo dell’organogenesi per determinare
embriotossicità e capacità di indurre malformazioni
scheletriche, di organi ed apparati;
• Studi di tossicità peri- e post-natale: per valutare
effetti durante ultimo trimestre di gravidanza e
lattazione. Studio di sviluppo fetale tardivo,
allattamento, svezzamento.
FASE I pre-impianto. 14 giorni somministrazione
(coprire ovulazione). Morte fetale e aborto.
FASE II organogenesi. Dal 6^ al 15^ giorno dopo
la fecondazione (topo), dal 6^ al 18^ giorno dopo
la fecondazione (coniglio). Malformazioni.
FASE III embrionale e neonatale. Ultimo quarto
della gravidanza e allattamento. Ritardo crescita,
deficits funzionali.
Studi tossicità in F1
•Pubertà
•Inizia il trattamento che prosegue per 100
giorni
•Accoppiamento e produzione della prima
nidiata (F1)
•Dopo 50 giorni inizia il trattamento degli F1
che prosegue per 120 giorni. Si accoppiano gli
F1 producendo gli F2
•Svezzamento degli F2, conta, misura del
peso, uccisione, necroscopia e istopatologia
PROVE DI MUTAGENESI
Test in vitro e in vivo, per valutare:
Induzione mutazioni geniche, danni cromosomici
e/o genomici, danni primari al DNA.
Completano studi
teratogenesi.
di
cancerogenesi
e
di
ICH (Inter. Conf. Harmonisation) fissa i termini
delle prove di mutagenesi, garantendo che ogni
composto sia esaminato in accordo con gli specifici
razionali scientifici.
Test di mutagenesi
CEE (GU NC 238 del 5 novembre 1984) stabilisce che i
test comprendano:
•Un test di mutazione genica sui batteri
•Un test di mutazione genica in un sistema eucariotico in
presenza o meno di induttori del metabolismo
•Un test di aberrazioni cromosomiche in colture di cellule
di mammifero
•Un test in vivo di danno genetico (i più convalidati sono
quelli a livello cromosomico, come il Mouse Spot Test)
Studi di cancerogenicità
Registrano incidenza di tumori (tessuti specifici) e/o
maligni e periodo di latenza prima della manifestazione.
Due specie animali (preferito ratto)
Somministrazione per la stessa via proposta per l’uomo
Documentazione assorbimento
Somministrazioni giornaliere
Gruppi sperimentali di almeno 100 animali (50 maschi e 50
femmine), uno per ogni livello di dose
Almeno tre dosaggi
Dosi per studi di cancerogenicità
• dose massima deve esercitare almeno un minimo
effetto tossico oppure una tossicità minima a livello di
organo bersaglio
• dose minima deve essere pari al doppio o al triplo della
dose terapeutica massima per l’uomo o della dose che
produce un effetto farmacologico nell’animale
• dose intermedia è la media geometrica fra la dose
massima e la dose minima
Periodo da 18 mesi (topo, criceto) ai 24 mesi (ratto)
Obiettivi degli studi di cancerogenicità
Identificare capacità di indurre tumori nell’animale e possibile
rischio per l’uomo
Sono richieste per nuove molecole ma particolarmente, per
quelle appartenenti a determinate categorie:
•molecole di una classe chimica che ha già dimostrato effetti
cancerogeni rilevanti anche per l’uomo;
•relazione struttura
cancerogeno;
attività
che
suggerisce
un
rischio
•evidenza di lesioni neoplastiche negli studi di tossicità ripetuta;
•ritenzione a lungo termine della molecola o suoi metaboliti, in
determinati organi;
•evidenze di positività nei test di mutagenesi.
Frequenza nei controlli (%)
N
Frequenza nei trattati (%)
60
30
20
10
10
17
65
241
-
5
13
35
76
464
1
10
27
46
114
Dimensioni del campione sperimentale richieste per ottenere differenze significative
(P<0.05) nella frequenza di tumori nel gruppo dei trattati rispetto a controlli con varie
frequenze di tumori spontanei.
Studi di tollerabilità locale: sono richiesti prima della
sperimentazione clinica se, la via di somministrazione topica è
rilevante per l’impiego nell’uomo o se si ritiene che la via
endovenosa possa determinare lesioni
•Prove di immunogenicità: sono effettuate per valutare la
capacità immunogenica e allergizzante di un farmaco, oltre alla
sua eventuale interferenza con il sistema immunitario
•Prove di pediatria: se si prevede utilizzo in bambini, può
essere necessario eseguire studi in ratti neonati.
Normalmente, si preferisce avviare studi pediatrici, solo se
in possesso di consistenti risultati nell’adulto e in presenza
dei test completi di tossicità della riproduzione, mutagenesi
e tossicità ripetuta
