Fenotipo di nodulazione ed espressione del gene nodA in

Università degli Studi di Firenze - Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Corso di Laurea Specialistica in Biotecnologie Ambientali e Industriali
Tesi di Diego Comparini
Relatore Dott. Alessio Mengoni
Correlatore Ch.mo Prof. Marco Bazzicalupo
Fenotipo di nodulazione ed espressione del gene nodA in ceppi di Sinorhizobium
meliloti
Introduzione - Sinorhizobium meliloti è un batterio del suolo che forma associazioni
simbiontiche (noduli radicali) con alcune specie di piante di notevole interesse agrario (es. erba
medica), nelle quali viene fissato l’azoto atmosferico. La fissazione dell’azoto operata dai batteri
nei noduli radicali condiziona positivamente la resa agronomica delle piante ed ha quindi un
notevole valore economico. Numerosi studi di biologia molecolare e genetica di popolazione hanno
evidenziato come a livello delle popolazioni naturali presenti nei noduli radicali vi sia un’alta
variabilità genomica e notevoli differenze nell’efficienza di formazione e sviluppo dei noduli
radicali (nodulazione). La ricerca dei determinanti genetici delle differenze nell’efficienza di
nodulazione è quindi un aspetto molto importante delle biotecnologie microbiche applicate
all’agricoltura. Quali siano infatti le basi molecolari di tali differenze non è ancora chiaro. In effetti
la nodulazione è un processo molto complesso che consta di diverse fasi successive. La prima fase
prevede il riconoscimento tra batterio e pianta attraverso la produzione di lipochitoligosaccaridi
(Fattore Nod) da parte del batterio in risposta alla presenza di essudati radicali della pianta. I geni
responsabili della sintesi del Fattore Nod, ed indotti dalla presenza di essudati radicali, sono i
cosiddetti geni nod, comprendenti l’operone nodABC.
Scopo - In questa tesi si sono sviluppate delle metodologie sperimentali ed analizzati alcuni
ceppi batterici di S. meliloti in relazione l’espressione dei geni dell’operone nodABC e
all’efficienza (fenotipo) di nodulazione.
Risultati - E’ stato messo a punto un test di PCR Real-Time volto a valutare l’espressione
del gene nodA, facente parte dell’operone nodABC, in seguito al trattamento della coltura batterica
con essudati radicali della pianta ospite modello Medicago truncatula. Si è monitorata la cinetica ed
il livello di espressione del gene nel ceppo di laboratorio Rm1021 ed in quattro ceppi naturali di S.
meliloti (AK83, AK58, BL225C, BO21CC). I risultati ottenuti hanno mostrato che i diversi ceppi
batterici hanno risposte trascrizionali estremamente variabili. In secondo luogo è stato messo a
punto un protocollo di nodulazione in vitro con il quale abbiamo analizzato il fenotipo dei batteri in
termini di efficienza di nodulazione (numero di noduli, cinetica di formazione dei noduli, colore e
dimensione dei noduli, peso secco della pianta). Anche qui i risultati ottenuti hanno evidenziato
notevoli differenze nell’efficienza di nodulazione tra i 5 ceppi in esame. L’analisi di correlazione tra
i parametri fenotipici ed i dati di espressione del gene nodA ha infine mostrato una sostanziale
assenza di correlazione lineare tra i due fenomeni.
Conclusioni – Nell’insieme i risultati ottenuti dimostrano l’esistenza di un’alta variabilità
nell’espressione del gene nodA e notevoli differenze nel fenotipo di nodulazione tra ceppi batterici
diversi. I bassi valori di correlazione tra espressione genica ed efficienza di nodulazione
suggeriscono che la cinetica di risposta agli essudati radicali non sia il fattore principale che
condiziona l’efficienza di nodulazione. Le sequenze complete del genoma di due dei ceppi sotto
indagine (BL225C e AK83), in corso di realizzazione presso il Joint Genome Instituteq, e l’analisi
trascrizionale degli stessi durante le fasi più tardive della nodulazione potranno probabilmente
contribuire a gettare maggiore luce sulle basi genetiche delle differenze fenotipiche osservate.