Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari Tesi di

Corso di Laurea Magistrale in Biotecnologie Molecolari
Tesi di Laurea di Arcangela Frascella
Analisi molecolari sui batteri endofiti in Medicago sativa
Relatore: Dott. Alessio Mengoni ([email protected])
Correlatore: Prof. Marco Bazzicalupo ([email protected])
Le piante ospitano un vasto range di batteri, definiti endofiti, che comprende specie
patogene, mutualiste e commensali, capaci di crescere all'interno ed intorno alle radici, nel sistema
vascolare e nei tessuti della porzione aerea della pianta. Le leguminose hanno inoltre sviluppato un
vero e proprio sistema di interazione simbiotica con particolari specie batteriche (rizobi) capaci di
fissare l'azoto atmosferico. Nonostante la notevole quantità di dati disponibili sulle basi molecolari
delle interazioni fra leguminose e rizobi, non è ancora chiara la diversità tassonomica ed il ruolo
ecologico della totalità dei batteri endofiti presenti. In questo contesto si inserisce anche il
modello più noto della biologia dei rizobi, la specie Sinorhizobium meliloti, il simbionte azoto
fissatore dell’erba medica (Medicago sativa). Differenti ceppi di S. meliloti possono infatti essere più
o meno competitivi per l’interazione simbiontica (formazione di noduli radicali) producendo, a
livello di popolazione, un possibile mix di differenti strategie: dalla vita libera, al commensalismo,
alla simbiosi. Data l’elevata variabilità genomica e metabolica mostrata dai ceppi naturali di S.
meliloti ci si aspetta che la capacità di colonizzare endofiticamente le piante sia un tratto variabile,
le cui basi genetiche non sono state ancora scoperte e che l’endosfera della pianta possa essere
una nicchia ecologica chiave, mai esplorata in questo contesto, per spiegare la co-presenza
nell’ambiente di ceppi dalle caratteristiche azoto-fissatrici e simbiontiche estremamente variabili.
In questa tesi si sono analizzate la composizione e le relazioni ecologiche della comunità
batterica totale presente nei diversi tessuti (noduli, steli e foglie) di tre linee di Medicago sativa e
nei rispettivi suoli e sono state valutate le densità delle popolazioni di S. meliloti nei diversi
ambienti, la loro diversità genetica e le capacità endofitiche del batterio in vitro.
I risultati ottenuti mediante analisi molecolari con T-RFLP e clone library screening hanno
evidenziato che in piante di Medicago sativa in vivo i noduli e la porzione aerea della pianta
ospitano comunità batteriche completamente distinte in cui sono molto abbondanti gli
appartenenti alla divisione batterica degli Alfa-Proteobatteri, un gruppo che comprende specie
note per le interazioni con gli eucarioti superiori (piante e animali) e di interesse per il
miglioramento biotecnologico. L’utilizzo della PCR Real-Time su marcatori specifici ha poi
permesso di individuare il rizobio S. meliloti in tutti gli ambienti analizzati (suolo, noduli, fusti,
foglie). Lo studio molecolare di queste popolazioni (mediante IGS-T-RFLP) ha poi evidenziato la
presenza di almeno due gruppi di popolazioni distinte di S. meliloti nel suolo e nei noduli radicali
delle piante. Si sono quindi sviluppati dei protocolli per lo studio in vitro della capacità di
colonizzazione della pianta da parte di S. meliloti ed è stata evidenziato che tutti i ceppi utilizzati
(sia ceppi naturali che di laboratorio) sono in grado di penetrare all'interno delle radici di M. sativa
ed, in misura minore, si ritrovano anche nella porzione aerea.
In conclusione si è evidenziato, per la prima volta in letteratura, che la leguminosa modello
M. sativa, è colonizzata da una vasta comunità batterica, che comprende specie di possibile
importanza biotecnologica per la protezione da patogeni ed il miglioramento della crescita della
pianta, e che il rizobio S. meliloti è in grado di colonizzare la pianta nel suo insieme e presenta in
natura un’elevata diversità genetica delle popolazioni, facendo ipotizzare che i ceppi simbionti
siano solo un sotto-insieme della popolazione totale.