BU - N. 12/2009 - Università degli Studi di Firenze

PROF. PIERANGELO GEPPETTI
CATTEDRA DI FARMACOLOGIA CLINICA
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DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E
CLINICA 'MARIO AIAZZI MANCINI'
Firenze, 27 ottobre 2009
PROGRAMMA DI RICERCA PER CUI SI RICHIEDE UN POSTO DI RICERCATORE A
TEMPO DETERMINATO
“RUOLO FISIOPATOLOGICO DEL CANALE TRPA1 IN CELLULE NEURONALI E
NON-NEURONALI”
INTRODUZIONE
I canali TRP.
I canali ionici di membrana hanno un ruolo centrale in molti processi cellulari. Il flusso
ionico generato dall’apertura di tali canali infatti è capace di variare l’eccitabilità di membrana o
di attivare secondi messaggeri intracellulari. In particolare gli ioni Ca2+ rivestono un ruolo
fondamentale nell’omeostasi ed in molti processi cellulari tra i quali la contrazione muscolare, il
rilascio di neuropeptidi, la proliferazione cellulare, la trascrizione genica e l’apoptosi agendo essi
stessi come secondi messaggeri. Per questo motivo esistono molte famiglie di canali ionici che
modulano l’entrata di tale ione tra i quali la famiglia dei recettori “transient receptor potential”
(TRP) (1).
La superfamiglia dei canali TRP rappresenta un eterogeneo e vasto gruppo di recettori
canale di membrana non selettivamente permeabili ai cationi. Il primo esempio, identificato già 30
anni fa in uno studio sui meccanismi di fototrasduzione nel moscerino della frutta Drosophila
melanogaster, era costituito da un canale associato alla rodopsina, il fotorecettore accoppiato a
proteina G, la cui attivazione determinava il reclutamento di una fosfolipasi C-β (PLC- β),
responsabile dell’influsso di Ca2+ (2). In seguito sono stati clonati recettori canale omologhi al
primo TRP, espressi sia negli invertebrati che nei vertebrati, e questa superfamiglia recettoriale è
diventata oggetto di grande interesse sia in campo fisiopatologico che farmacologico, sia per la sua
vasta distribuzione nei vari tipi cellulari che per il caratteristico pleiotropismo funzionale. Cellule
di lievito, ad esempio, utilizzano un sottotipo recettoriale dei canali TRP per percepire ed adattarsi
ad un ambiente esterno ipertonico. I nematodi presentano canali TRP nei loro organi olfattivi per
percepire sostanze chimiche dannose. Il maschio del topo utilizza un canale TRP sensibile ai
feromoni per distinguere i maschi dalle femmine. L’uomo, infine, utilizza canali TRP per
percepire il caldo, il freddo ed alcuni gusti come il dolce ed il salato. Le proteine canale TRP sono
coinvolte inoltre in processi di trasduzione di stimoli sensoriali di natura meccanica, ed alcune
anche in fenomeni di nocicezione. Ad oggi la superfamiglia di recettori TRP conta 56 sottotipi
suddivisi in 7 classi in base all'omologia nella sequenza amminoacidica dei differenti sottotipi
1
recettoriali (3). I recettori TRP di mammifero omologhi ai TRP identificati nella Drosophila
definiti canonici o TRPC, sono canali non selettivi per i cationi Ca2+ e Na+, e sono attivati in
seguito a stimolazione della fosfolipasi C. La sottofamiglia TRPP viene divisa in base alla
struttura recettoriale in proteine PKD1-like (TRPP1-like) e proteine PKD2-like (TRPP2-like). I
TRPP1 presentano una struttura diversa da tutti gli altri TRP, con ben 11 domini transmembrana,
mentre i TRPP2 presentano una struttura classica. Questi recettori sembrano essere localizzati a
livello nucleare ed avere come bersaglio funzionale gli endosomi/lisosomi. I membri della
sottofamiglia dei recettori melastatinici o TRPM vengono ulteriormente distinti, in base ad
analogie strutturali, in 3 sottogruppi, caratterizzati da una elevata permeabilità agli ioni Ca2+ e
Mg2+. I recettori TRPN comprendono il sottotipo NONMPC, che presenta un'elevata analogia
strutturale con il TRPA1. Il recettore NONMPC nella Drosophila, necessario per il volo e per la
trasduzione di stimoli di natura meccanica, presenta, infatti, numerosi domini ankirinici a livello
della porzione amminoterminale.
La sottofamiglia dei recettori attivati dai vanilloidi o TRPV conta 6 sottotipi (1-6), tra i quali
il TRPV1, e costituisce la sottofamiglia più studiata. I TRPV sono attivati da stimoli di varia
natura chimica (il recettore TRPV1 è noto anche come recettore per la capsaicina) e meccanica,
ma i sottotipi TRPV1-TRPV4, sono caratteristicamente sensibili anche a stimoli termici. I sottotipi
TRPV5-TRPV6 in condizioni fisiologiche presentano, unici tra tutti i TRP, un'elevata selettività
per lo ione Ca2+, dal quale risultano direttamente attivabili. I recettori TRP sono quindi coinvolti in
numerosi eventi fisiopatologici e la loro distribuzione, vasta e complessa, risulta di difficile sintesi
e schematizzazione. Di particolare interesse per la nostra trattazione è l’osservazione che TRPV1,
TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPM8 e TRPA1, sono espressi in neuroni sensitivi primari nocicettivi.
Il TRPM8 è sensibile al freddo nocivo ed al mentolo, il TRPV2 al caldo nocivo ed il TRPA1 al
freddo nocivo. Il TRPV4, è sensibile alle variazioni di osmolarità e quindi allo
stiramento/distensione cellulare.
Un aspetto rilevante di alcuni canali TRP espressi nei nocicettori, come il TRPV1 ed il
TRPA1, è relativo alla possibilità di una loro attivazione di tipo “metabotropo”, per cui in seguito
alla stimolazione di recettori accoppiati a proteine G (GPCR) si produrrebbe una cascata
metabolica con generazione di molecole di natura lipidica capaci di attivare i TRP e quindi
provocare l’entrata di Ca2+. Questa modalità di attivazione dei TRP sembra essere anche legata
alla stimolazione di recettori tirosin-chinasici come il recettore ad alta affinità per il fattore di
crescita nervoso (NGF). L’attivazione della PLC che segue la stimolazione recettoriale, per
idrolizzare il fosfatidil-inositolo-difosfato (PIP2) da cui si formano diacilglicerolo (DAG) e
inositolo-tri-fosfato (IP3), ne determina il distacco dal canale TRP causando così il gating di
quest’ultimo. Tra i numerosi esempi di recettori in grado di attivare indirettamente i TRP troviamo
il recettore muscarinico, il recettore H1 per l'istamina, i recettori per le purine, il recettore B2 per
la bradichinina e i recettori attivati dalle proteasi (PAR). Il TRPV4 come il TRPV1, va incontro a
sensibilizzazione ed attivazione da parte di stimolazione del recettore PAR2.
Il canale TRPA1.
Il canale TRPA1, inizialmente identificato in fibroblasti fetali umani (4), è anche espresso
nelle cellule ciliate (5), nelle quali la sua funzione biologica risulta ancora poco chiara, e nelle
cellule enterocromaffini dell'intestino dove regola il rilascio di serotonina e la motilità intestinale
(6). Una delle localizzazioni più rilevanti del canale TRPA1 è a livello di una sottopopolazione di
neuroni somatosensitivi e nocicettivi dei gangli della radice dorsale (DRG), dei gangli trigeminali
o dei gangli sensitivi vagali, a livello di tali neuroni risulta colocalizzato con il recettore canale
TRPV1 (7). I neuroni che esprimono il canale TRPA1 sono, infatti, caratterizzati dalla specifica
sensibilità per la capsaicina, il principio pungente contenuto nel peperoncino che attiva
selettivamente il canale TRPV1, e per l'espressione/secrezione dei neuropeptidi proinfiammatori,
la sostanza P (SP) ed il calcitonin gene-related peptide (CGRP). Oltre al coinvolgimento nella
trasmissione di stimoli irritanti e dolorosi, che attivano risposte riflesse, la stimolazione dei
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terminali nervosi TRPA1 positivi produce una serie di risposte proinfiammatorie locali, dovute
alla liberazione dei neuropeptidi proinfiammatori e complessivamente definita “infiammazione
neurogenica”. Il canale TRPA1 coesiste a livello dei neuroni sensitivi primari con il TRPV1, il
TRPV2, il TRPV3 ed il TRPV4. Le proprietà pungenti ed irritanti della mostarda (allile
isotiocianato), dell'aglio (allicina), della cannella (cinnamaldeide) e di altre spezie sono dovute alla
loro capacità di attivare il canale TRPA1. Il canale TRPA1 viene proposto come sensore di danno
tissutale, in quanto attivato da numerose specie chimiche endogene o esogene generate dallo stress
ossidativo. Inoltre, vari agenti fisiopatologicamente rilevanti, sia endogeni che esogeni, sono stati
identificati come agonisti del canale TRPA1. Recentemente è stato descritto il meccanismo con
cui il canale TRPA1 viene attivato dal freddo nocivo (18-25°C) (8) e come, attraverso questo
meccanismo, produce una risposta infiammatoria neurogenica a livello delle vie aeree (9). Le
prostaglandine e gli isoprostani ciclopentenoni (PGJ2, PGA, 8-iso-PGA2), prodotti attraverso un
meccanismo non enzimatico da una via metabolica ossidativa COX-indipendente, si sono rivelati
anch'essi agonisti selettivi TRPA1 (10).
Localizzazione del canale TRPA1 in tessuti non neuronali.
L'identificazione dell'espressione di canali ionici TRPA1 in vari tipi cellulari è un'area di
ricerca di estremo interesse ed in rapido avanzamento, che sta mettendo in luce funzioni inattese di
questo recettore pleiotropico sia nella fisiologia che nella patologia. La localizzazione ed il
funzionamento del canale TRPA1 hanno un’importanza chiave per promuovere la scoperta e lo
sviluppo di antagonisti del canale TRPA1 e per la loro utilizzazione nel trattamento innovativo di
malattie umane. Sebbene il gene che codifica per il canale TRPA1 sia stato originariamente
scoperto in fibroblasti fetali umani, è la sua localizzazione in una sottopopolazione di neuroni
sensitivi primari che ha prodotto una serie di osservazioni sulla trasmissione nocicettiva in modelli
animali di dolore infiammatorio, neuropatico ed oncologico. Infatti, il canale TRPA1 espresso nei
neuroni somatosensitivi codifica segnali nocicettivi causati non solo da basse temperature nocive
(18-25°C), ma anche da una larga serie di metaboliti dello stress ossidativo, nitrativo e carbonilico,
tra cui il perossido di idrogeno (H2O2) (11), il 4-idrossinonenale (HNE) (12), l’acroleina (13) ed
altri (14). Recentemente è stato riportato che il canale TRPA1 viene attivato da un altro gruppo di
mediatori proinfiammatori, quali prostaglandine ed isoprostano ciclopentenoni (10). Il canale
TRPA1 non è stato localizzato solo su neuroni somatosensitivi, ma esistono evidenze che esso sia
espresso in maniera rilevante anche in cellule non neuronali, come le cellule ciliate del sistema
uditivo (5). Più recentemente, è stato dimostrato che cellule enterocromaffini del tratto
gastrointestinale, sia di ratto che umane, esprimono livelli consistenti di mRNA per il canale
TRPA1 (6). Il canale TRPA1 è stato inoltre rilevato, sia a livello trascrizionale che proteico, nelle
cellule uroteliali della vescica urinaria di ratto (15). Nel tratto genitourinario umano il recettore
TRPA1, oltre che nelle fibre CGRP/TRPV1 positive, è stato infatti identificato in cellule epiteliali
della vescica e nella ghiandola prostatica. L'analisi mediante RT-PCR del mRNA del recettore
TRPA1 ha rivelato che il canale ionico è espresso nel ratto secondo il seguente ordine di
grandezza decrescente: stomaco, piccolo intestino, vescica urinaria, colon, gangli delle radici
dorsali, polmone, pancreas (16). Altri tessuti mostrano una minore espressione (midollo spinale,
cervello, cuore, cute) ed altri non esprimono affatto il canale (muscolo scheletrico). Poiché
l'mRNA del recettore TRPA1 localizzato a livello dei neuroni sensitivi non contribuisce ai livelli
di espressione del canale ionico a livello dei tessuti periferici, è probabile che, come evidenziato
nelle cellule enterocromaffini nell'intestino, altri tipi cellulari, localizzati ad esempio a livello
polmonare, a livello del pancreas e del tratto genitourinario, esprimano il canale TRPA1 (16).
3
Il ruolo fisiologico del canale TRPA1 espresso a livello di tessuti extra-neuronali.
L'attivazione del canale TRPA1, come per la grande maggioranza dei canali TRP, causa
l'entrata di cationi, ed in particolare calcio, nella cellula e la misurazione di questo fenomeno è
utilizzato come test di screening per l'identificazione funzionale dei canali TRP. Agonisti selettivi
per il canale TRPA1 sono stati descritti ed utilizzati di routine a scopo di screening ed includono i
principi pungenti contenuti nella cannella (cinnamaldeide) e nella mostarda (allile isotiocianato).
Anche le aldeidi α,β insature, come HNE ed acroleina attivano selettivamente il canale TRPA1.
Alcuni composti (rosso rutenio, canfora, gentamicina) sono dotati di proprietà antagonistiche
relarivamente non selettive. Recentemente è stato descritto il primo antagonista selettivo per il
canale TRPA1, HC-030031 (17). La mobilizzazione di calcio mediata dal canale TRPA1 causa
risposte cellule-specifiche, per esempio nei neuroni sensitivi contenenti neuropeptidi, in tale sede,
infatti, l'apertura del canale si traduce nel rilascio di SP e di CGRP che a livello periferico causa
una serie di risposte proinfiammatorie, complessivamente definite come "infiammazione
neurogenica". L'infiammazione neurogenica comprende sia risposte vascolari (vasodilatazione
arteriosa, stravaso di plasma, accumulo di neutrofili) che non vascolari (contrazione o
rilasciamento del muscolo liscio, secrezione ghiandolare ed altri effetti) (18). Nelle cellule
enterocromaffini gastrointestinali l'attivazione del TRPA1 media, invece, il rilascio di serotonina
(6). Nella mucosa vescicale umana, nello strato muscolare vescicale e nella prostata i livelli di
espressione dell’mRNA per il canale TRPA1 si trovano in un rapporto di 639:1:16 e l'mRNA del
TRPA1 nella mucosa vescicale di pazienti con ostruzione vescicale è significativamente
aumentata rispetto ai controlli (2.32 volte), suggerendo un contributo del canale TRPA1 alla
patogenesi di questa condizione (19).
Il ruolo delle aldeidi (e dei ROS) come molecole di segnale del canale TRPA1 ed il loro ruolo
fisiopatologico a livello dell'espressione del canale TRPA1 in tessuti extra-neuronali.
Lo stress ossidativo è stato correlato alla patogenesi di una grande varietà di malattie. Lo
stress ossidativo è associato a, o genera, stress nitrativo e stress carbonilico attraverso la
produzione di molecole endogene caratterizzate da un'alta reattività e dalla capacità di causare
danno irreversibile di DNA, proteine ed altri bersagli chiave per il funzionamento e la
sopravvivenza cellulare. I prodotti dello stress ossidativo (ROS), nitrativo (RNS) e carbonilico
(RCS) sono stati recentemente riconosciuti come molecole di segnale. Un bersaglio specifico
comune per questa altrimenti eterogenea serie di composti, è rappresentato dal canale TRPA1, che
proprio per questa ragione è considerato un sensore dello stress ossidativo, nitrativo e carbonilico
(11). Questa ipotesi si adatta in maniera convincente al TRPA1 espresso sui neuroni
somatosensitivi, le cui funzioni primarie sono quelle di allertare contro stimoli nocivi che mettano
a rischio l'integrità tissutale e, attraverso il rilascio locale di neuropeptidi, di avviare una risposta
difensiva immediata attraverso l'infiammazione neurogenica. L'ipotesi alla base di questo progetto
è duplice. Noi proponiamo, come prima ipotesi, che meccanismi neurogenici TRPA1-mediati
siano coinvolti nella fisiopatologia di alcune malattie e, secondariamente, che il TRPA1 espresso
in cellule non neuronali, e principalmente in cellule epiteliali, riconosca prodotti dello stress
ossidativo, nitrativo e carbonilico avviando risposte protettive dirette al mantenimento
dell'omeostasi tissutale. Una conseguenza di tale ipotesi è che, se la stimolazione del canale
TRPA1 sia a livello neuronale che non neuronale è prolungata o marcata, anziché protezione e
riparazione tissutale, questa potrebbe risultare in una risposta infiammatoria incontrollata e
dannosa. Per analogia a quanto osservato in numerosi studi relativi al canale TRPV1, la cui
stimolazione massiva causa morte cellulare (apopotosi e necrosi) attraverso un sovraccarico di
calcio ed altri ioni, noi proponiamo che anche l'iperstimolazione del canale TRPA1 si traduca in
effetti tossici importanti a livello cellulare.
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Asma e BPCO.
Ci sono sempre maggiori evidenze che un aumentato stress ossidativo contribuisca
all'infiammazione asmatica ed a quella della bronco pneumopatia cronica ostruttiva (BPCO). Le
cellule infiammatorie infiltranti le vie aeree contribuiscono allo stress ossidativo durante le
reazioni allergiche nelle vie respiratorie, ed aumentati livelli di ROS nelle cellule epiteliali sono
stati osservati in seguito all’esposizione ad allergeni. Quindi, molteplici fonti di ROS possono
produrre aumentati livelli di RNS e RCS, contribuendo al fenotipo asmatico e BPCO. La
misurazione delle aldeidi nell'aria espirata è stata proposta come mezzo per valutare la
perossidazione lipidica in vivo. L'8-isoprostano risulta aumentato nel condensato di aria espirata,
nel fluido di lavaggio broncoalveolare e nelle urine di pazienti asmatici. L'attivazione di
terminazioni nervose sensitive delle vie aeree partecipa alla risposta infiammatoria in modelli di
asma nei roditori. Il meccanismo responsabile di tale attivazione, rimane, comunque, ignoto. Il
canale TRPA1, originariamente clonato in fibroblasti polmonari umani, viene espresso in maniera
funzionale da questo tipo di cellule. Per analogia con i sistemi gastrointestinale e genitourinario, è
possibile che altre tipi cellulari polmonari esprimano il canale TRPA1 funzionalmente attivo.
Questa ipotesi è ulteriormente supportata dalla osservazione che nel polmone di ratto l'mRNA per
il canale TRPA1 è espresso in maniera consistente (simile a quanto osservato nei gangli delle
radici dorsali del midollo spinale) (20). La nostra ipotesi è che l’attivazione del canale TRPA1 ad
opera di ROS, RNS e RCS, generati durante la reazione allergica e nei processi infiammatori
cronici della BPCO, contribuisca alla risposta infiammatoria neurogenica ad allergeni ed agenti
tossici del fumo di sigaretta che interessano le vie aeree e che, il canale TRPA1 espresso su cellule
non-neuronali, contribuisca al fenotipo asmatico infiammatorio sia nell'animale (modello
sperimentale) che nell'uomo.
SCOPO DELLA RICERCA
Lo scopo del presente programma di ricerca è orientato alla:
1. esplorazione attraverso ibridazione in situ, RT-PCR e immunoistochimica la presenza e
l’esatta localizzazione cellulare del TRPA1 nei tessuti extraneuronali ed in particolare nelle vie
aeree e nel polmone;
2. valutazione della capacità degli agonisti selettivi per il canale TRPA1 di attivare, e degli
antagonisti selettivi per il canale TRPA1 di inibire, la mobilizzazione di calcio intracellulare in
cellule precedentemente identificate per l'espressione dell'mRNA e della proteina del canale;
3. studio della capacità degli agonisti selettivi del TRPA1 di attivare, e degli antagonisti selettivi
del TRPA1 di inibire, sia nei neuroni sensitivi primari che in cellule non neuronali, vie
proinfiammatorie ed, in condizioni di iperstimolazione, danno cellulare. Il rilascio di mediatori
infiammatori (prostanoidi, citochine ed altri mediatori) ed il danno cellulare (apoptosi e necrosi)
saranno studiati in cellule che esprimono il TRPA1;
4. analizzare se: i. l'espressione e la funzione del TRPA1 sono influenzate dallo sviluppo di
patologie proinfiammatorie (ad es. asma e BPCO); ii. lo sviluppo di tali patologie sono influenzate
dalla delezione genetica del canale TRPA1; iii. gli antagonisti del canale TRPA1 possono essere
impiegate nel trattamento farmacologico;
5. infine, valutare se: i. il canale TRPA1 media la componente neurogenica della risposta
allergica infiammatoria nei roditori; ii. il TRPA1 non neuronale contribuisce al danno epiteliale e
ad altri fenomeni di rimodellamento tissutale della reazione asmatica.
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METODI
Le metodiche utilizzate prevedono: culture cellulare di vari tipi cellulari ed in particolare la
coltura di neuroni dei gangli delle radici dorsali e di gangli giugulari di roditori; studio della
mobilizzazione di calcio intracellulare in cellule isolate mediante tecnica di “calcium imaging”;
analisi della localizzazione del recettore TRPA1 in tessuti extra-neuronali mediante ibridazione in
situ; RT-PCR per valutare i livelli di espressione per mRNA del recettore TRPA1 ed
immunoistochimica per l’espressione della proteina canale a livello dei vari tessuti e dei differenti
tipi cellulari; rilascio di neuropeptidi CGRP e SP da tessuti periferici; dosaggio del rilascio dei vari
mediatori proinfiammatori (cito/chemochine) dai vari tessuti periferici; test di nocicezione,
allodinia ed iperalgesia in vivo.
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Prof. Pierangelo Geppetti
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