DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA
"MARIO AIAZZI MANCINI"
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Firenze, 28 Novembre 2011
Oggetto: Progetto Bando per 1 Assegno di Ricerca
Data decorrenza: 1 Febbraio 2012
Titolo Progetto:
Studio del ruolo funzionale e fisiopatologico dei recettori TRP espressi nei neuroni
sensitivi primari.
Introduzione:
La famiglia dei canali "transient receptor potential (TRP)” comprende un gruppo di canali
cationici non selettivi con funzioni pleiotropiche che spaziano dall’omeostasi del calcio
intracellulare alla percezione di una grande varietà di stimoli di diversa natura (chimica,
meccanica o termica) prodotti a livello endogeno ed esogeno. I canali TRP mediano il
flusso transmembrana di cationi secondo il loro gradiente elettrochimico, determinando un
incremento intracellulare di ioni calcio/sodio e di conseguenza depolarizzazione cellulare.
Lo ione calcio è riconosciuto come attivatore di meccanismi proteici, calcio-dipendenti, che
controllano eventi cellulari quali la regolazione della trascrizione genica, la proliferazione
cellulare e l’induzione di meccanismi infiammatori. Tale famiglia di canali regolando un
ampio spettro di funzioni biologiche, nei mammiferi comprende 6 sottofamiglie: TRPC
(canonici), TRPM (melastatinici), TRPV (vanilloidi), TRPP (policistinici), TRPML
(mucolipidici) e la sottofamiglia recentemente identificata dei TRPA (anchirinici) (TRPA1).
La rilevanza della famiglia di canali TRP nella patologia umana è sottolineata da
evidenze che il canale TRPV1 è un mediatore chiave del dolore neuropatico ed
infiammatorio, TRPV6 e TRPM8 sono markers importanti del cancro della prostate e che
mutazioni a carico di TRPP1 o TRPP2 provocano la malattia renale policistica. Il TRPA1
coesiste a livello dei neuroni sensitivi primari con il TRPV1, il TRPV2, il TRPV3 ed il
TRPV4. Le proprietà pungenti ed irritanti della mostarda (allile isotiocianato), dell'aglio
(allicina), della cannella (cinnamaldeide) e di altre spezie sono dovute alla loro capacità di
attivare il canale TRPA1. Una delle maggiori scoperte nella ricerca sui TRP negli ultimi
anni è che TRPA1 debba essere considerato sensore del danno tissutale, in quanto
attivato da numerose specie chimiche endogene o esogene generate dallo stress
ossidativo. Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e le specie reattive dell'azoto (RNS)
sono generate a livello cellulare sia tramite un meccanismo enzimatico che non
enzimatico.
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"MARIO AIAZZI MANCINI"
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I neuroni sensitivi primari peptidergici che esprimono il recettore TRPV1, attivato
dalla capsaicina (principio pungente del peperoncino), sono definiti neuroni sensitivi
capsaicino-sensibili. I neuroni sensitivi primari capsaicino-sensibili rappresentano un
sottogruppo di neuroni sensitivi primari, di piccolo diametro che danno origine a fibre
nervose di tipo C e Aδ deputate alla conversione di tutti gli stimoli natura chimica
meccanica e termica, provenienti dall’ambiente interno ed esterno del nostro organismo, in
segnali elettrochimici a livello del sistema nervoso centrale. La stimolazione del canale
TRPV1 o del canale TRPA1 nei neuroni sensitivi primari produce il rilascio di neuropeptidi
come il “calcitonin gene-related peptide” (CGRP) e la sostanza P (SP). Il rilascio di
neuropeptidi dai terminali centrali dei neuroni sensitivi contribuisce alla trasmissione del
dolore, mentre il rilascio di neuropeptidi dai terminali periferici produce una serie di
risposte infiammatorie, collettivamente definite come infiammazione neurogenica. Nelle vie
aeree, l’infiammazione neurogenica comprende iperemeia, stravaso di proteine
plasmatiche, broncocostrizione e infiltrazione leucocitaria, ed è stato proposto che possa
contribuire alle patologie respiratorie di natura infiammatoria, tra le quali l’asma.
Recenti studi hanno messo in evidenza il coinvolgimento del canale TRPA1 nelle
patologie di carattere infiammatorio dell'apparato respiratorio, della vescica, dell' esofago,
e del tessuto vascolare. Inoltre, la localizzazione di tale recettore a livello dei neuroni
sensitivi primari, ha prodotto una serie di osservazioni relative al coinvolgimento di tale
canale nella trasmissione nocicettiva in modelli animali di dolore infiammatorio,
neuropatico ed oncologico.
Sembra quindi emergere chiaramente il ruolo del canale TRPA1 espresso nei
neuroni sensitivi primari, come recettore segnale in grado di percepire ed allertare
l'organismo in seguito ad eventi dannosi e contemporaneamente attuare una prima linea di
difesa, attraverso l'infiammazione neurogenica, contro l'azione nociva sia di vari composti,
prodotti a livello endogeno (prodotti dello stress ossidativo, nitrativo, carbonilico) che
agenti tossici derivanti dall'ambiente esterno. La possibilità che i prodotti dello stress
ossidativo e nitrativo generati in presenza di uno stato infiammatorio o in caso di danno
tissutale abbiano come bersaglio il recettore TRPA1 e, che attraverso l'attivazione di tale
recettore producano dolore ed infiammazione neurogenica, rappresenta una delle ipotesi
iniziale del presente progetto di studio. E lo studio di antagonisti selettivi di tale recettore
rappresenta un punto importante per la scoperta di nuovi farmaci che potrebbero essere
utilizzati nel trattamento di stati dolori o infiammatori.
Obiettivi:
L’obiettivo di questo progetto di ricerca è quello di studiare il ruolo funzionale dei recettori
canale espressi a livello dei neuroni sensitivi primari capsaicino-sensibili, in condizioni
infiammatorie e dolorose persistenti in vari modelli animali o in vitro. Inoltre, tale progetto si
propone di caratterizzare un ruolo fisiopatologico di tali canali nel mediare risposte proinfiammatorie indotti da stimoli irritanti. Mediante l’utilizzo dei molteplici agonisti di origine
naturale dei recettori TRP lo studio dell'attivazione neuronale trigeminale da parte di
questa sostanze potrebbe essere un buon modello di studio dei meccanismi coinvolti
nell'induzione dell'emicrania derivante dai composti di origine esogena, naturale.
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Il progetto si articolerà in due fasi:
La prima fase del progetto sarà caratterizzata dallo studio dell’espressione e ruolo
funzionale del canale TRP espresso a livello delle fibre nervose sensitive primarie
caratterizzate per la loro specificità di carattere elettrofisiologico, neurochimico e
morfologico. Verrà valutato il possibile coinvolgimento fisiopatologico del recettori canale i
nel mediare risposte pro-infiammatorie indotta da stimoli irritanti nello sviluppo della
patologie dolorose ed infiammatorie. Tale attività sarà valutata mediante saggi in vitro, a)
neurosecrezione di peptidi pro-infiammatori (CGRP e sostanza P) dai preparati contenenti
terminali dei neuroni sensitivi primari in seguito a stimolazione con agonisti noti dei canali
TRP, b) dosaggio di citochine pro-infiammatorie, prostanoidi o altri mediatori infiammatori,
rilasciate in seguito a stimolazione recettoriale con i vari agonisti specifici. Mediante studi
in vivo verranno valutate inoltre a) stravaso di proteine plasmatiche da vari organi e
tessuti, in seguito a trattamento con agonisti noti dei canali TRP, b) stravaso di neutrofili e
valutazione della loro attivazione tissutale mediante il dosaggio dell’attività della
mieloperossidasi o valutazione dell’elastasi neutrofilica; c) valutazione della secrezione di
vari patterns di citochine nei vari tessuti mediante metodi ELISA. Per ciascun effetto verrà
anche valutata la capacità di alcuni agonisti con presumibile valore fisiopatologico ed
antagonisti selettivi, di attivare ed inibire, rispettivamente, queste risposte. In una seconda
fase del progetto, attraverso metodiche atte a dimostrare l'espressione della proteina (RTPCR ed analisi immunoistochimica e Western Blotting), verrà indagata la presenza dei vari
recettori nei diversi organi e tessuti. Inoltre in base alla localizzazione dei vari recettori
verranno valutati mediante studi funzionali di “calcium imaging”, la risposta di tali recettori
in seguito a stimolazione con agonisti selettivi ed in presenza o meno di pretrattamento
con antagonisti selettivi dei canali presi in considerazione.
Prof. Pierangelo Geppetti
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