Firenze, 16 Dicembre 2010 Oggetto: Progetto Bando per 1 Assegno

DIPARTIMENTO DI FARMACOLOGIA PRECLINICA E CLINICA ʺMARIO AIAZZI MANCINIʺ ____________________
Firenze, 16 Dicembre 2010
Oggetto: Progetto Bando per 1 Assegno di Ricerca
Data decorrenza: 1 Marzo 2011
Titolo Progetto:
Studio del ruolo fisiopatologico del recettore TRPA1, espresso nei neuroni sensitivi
primari e nelle cellule non-neuronali, nei processi infiammatori cronici.
Introduzione:
Il recettore TRPA1 appartiene alla superfamiglia dei canali “Transient Receptors Potential”
(TRP), che rappresentano un ampio ed eterogeneo gruppo di canali ionici di membrana
non selettivi con funzioni pleiotropiche che spaziano dall’omeostasi del calcio intracellulare
alla percezione di una grande varietà di stimoli di diversa natura (chimica, meccanica o
termica), prodotti sia a livello endogeno che esogeno. Nonostante la recente
identificazione del recettore TRPA1 (1999), solo negli ultimi anni sono state ottenute
maggiori conoscenze relative alle caratteristiche morfologiche e funzionali di questo
canale ed il suo coinvolgimento in molti fenomeni biologici.
L'interesse relativo a questo canale e il suo coinvolgimento in ambito fisiopatologico è
cresciuto enormemente negli ultimi anni, per la sua identificazione come nocicettore, cioè
recettore deputato alla traduzione degli stimoli dolorosi. Il canale TRPA1, infatti, risulta
selettivamente espresso in una sottopopolazione di neuroni sensitivi primari peptidergici,
coespresso con recettore TRPV1, attivato dalla capsaicina (principio pungente del
peperoncino), e per questo definiti capsaicino-sensibili. I neuroni sensitivi primari
capsaicino-sensibili rappresentano un sottogruppo di neuroni sensitivi primari, di piccolo
diametro che danno origine a fibre nervose di tipo C e Aδ deputate alla conversione di tutti
gli stimoli natura chimica meccanica e termica, provenienti dall’ambiente interno ed
esterno del nostro organismo, in segnali elettrochimici a livello del sistema nervoso
centrale. La mobilizzazione di calcio mediata dall'attivazione del recettore TRPA1 causa
risposte cellule-specifiche, per esempio nei neuroni sensitivi contenenti neuropeptidi
l'apertura del canale si traduce nel rilascio di sostanza P (SP) e di calcitonin gene-related
peptide (CGRP) che a livello periferico causa una serie di risposte proinfiammatorie,
complessivamente definite come "infiammazione neurogenica". L’infiammazione
neurogenica comprende sia risposte vascolari, quali vasodilatazione arteriosa, stravaso di
plasma, accumulo di neutrofili, che non vascolari, come la contrazione o il rilasciamento
del muscolo liscio, la secrezione ghiandolare. Recenti studi hanno messo in evidenza il
coinvolgimento del canale TRPA1 nelle patologie di carattere infiammatorio dell'apparato
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respiratorio, della vescica, dell' esofago, e del tessuto vascolare. Inoltre, la localizzazione
di tale recettore a livello dei neuroni sensitivi primari, ha prodotto una serie di osservazioni
relative al coinvolgimento di tale canale nella trasmissione nocicettiva in modelli animali di
dolore infiammatorio, neuropatico ed oncologico. Negli ultimi anni sono stati fatti molti
progressi nell'identificazione di agenti in grado di attivare il recettore TRPA1. Numerosi
sono gli agonisti naturali identificati derivanti da estratti di piante in grado di attivare tale
canale, tra questi ricordiamo la cinnamaldeide, contenuta nella cannella; l’allile
isotiocianato, contenuto nella mostarda e l’allicina, principio pungente contenuto nell'aglio.
Negli ultimi anni sono stati identificati, inoltre molti irritanti di origine ambientale in grado di
attivare il recettore TRPA1, l'acroleina, contenuta nell’estratto del fumo di sigaretta, e
irritanti di natura volatile come la formalina. Più recentemente, tale recettore è stato
identificato come target di una serie di aldeidi α,β-insature prodotte a livello endogeno,
prodotti dalla perossidazione lipidica in seguito a processi infiammatori o danno tissutale.
Queste aldeidi includono il 4-idrossi-2-nonenale (4-HNE) o il 4-oxononenale (4-ONE) ma
anche molti prodotti intermedi generati durante i processi infiammatori, come
prostaglandine e isoprostani-ciclopentenoni. Recentemente i il recettore TRPA1 è stato
anche riconosciuto come bersaglio specifico dei prodotti dello stress ossidativo nitrativo e
carbonilico
Sebbene molti studi siano focalizzati alla caratterizzazione funzionale del recettore
TRPA1 a livello dei neuroni sensitivi primari, in cui è ben definita la sua espressione,
altrettanti studi sono rivolti alla individuazione e caratterizzazione di tale recettore in cellule
non appartenenti ai distretti neuronali. L'identificazione dell'espressione del TRPA1 in
cellule non-neuronali, rappresenta infatti un'area di ricerca in rapido avanzamento, che sta
mettendo in luce funzioni non attese di questo recettore sia nella fisiologia che nella
patologia. Esistono molte evidenze che tale recettore sia abbondantemente espresso in
cellule diverse dalle neuronali, come le cellule ciliate. Più recentemente, è stata dimostrata
un'espressione consistente del TRPA1 in cellule enterocromaffini del tratto
gastrointestinale, sia nei roditori che nell’uomo. Il canale TRPA1 è stato inoltre identificato,
sia a livello trascrizionale che proteico, nelle cellule uroteliali della vescica di ratto. Ulteriori
studi, hanno individuato la presenza di questo recettore anche a livello dei cheratinociti
della membrana basale dell'epidermide.
Sembra quindi emergere chiaramente il ruolo del canale TRPA1 espresso nei
neuroni sensitivi primari, come recettore segnale in grado di percepire ed allertare
l'organismo in seguito ad eventi dannosi e contemporaneamente attuare una prima linea di
difesa, attraverso l'infiammazione neurogenica, contro l'azione nociva sia di vari composti,
prodotti a livello endogeno (prodotti dello stress ossidativo, nitrativo, carbonilico) che
agenti tossici derivanti dall'ambiente esterno. A livello non-neuronale, nonostante
l’identificazione del canale TRPA1 in varie cellule, ancora non è stato ancora descritto un
ruolo funzionale specifico. La possibilità che i prodotti dello stress ossidativo e nitrativo
generati in presenza di uno stato infiammatorio o in caso di danno tissutale abbiano come
bersaglio il recettore TRPA1 e, che attraverso l'attivazione di tale recettore producano
dolore ed infiammazione neurogenica, rappresenta una delle ipotesi iniziale del presente
progetto di studio. E lo studio di antagonisti selettivi di tale recettore rappresenta un punto
importante per la scoperta di nuovi farmaci che potrebbero essere utilizzati nel trattamento
di stati dolori o infiammatori. Poiché il canale TRPA1 è definito come sensore di stress
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ossidativo e nitrativo, e dato il coinvolgimento dello stress ossidativo e nitrativo in patologie
respiratorie come asma e BPCO, la nostra attenzione sarà rivolta anche all’identificazione
del ruolo di questo canale in cellule non-neuronali del sistema respiratorio.
Obiettivi:
L’obiettivo di questo progetto di ricerca è quello di studiare il ruolo funzionale del canale
TRPA1, espresso nei neuroni sensitivi primari capsaicino-sensibili, in condizioni
infiammatorie e dolorose persistenti in vari modelli animali o in vitro. Inoltre, tale progetto si
propone di identificare l'espressione del recettore TRPA1 in altri tipi cellulari non-neuronali,
ad esempio cellule residenti nelle vie aeree e successivamente, caratterizzarlo da un
punto di vista funzionale, al fine di definire il possibile ruolo di tale recettore in patologie
infiammatorie a carico delle vie aeree come asma e broncopneumopatia cronico ostruttiva
(BPCO).
Articolazione del progetto:
Il progetto si articolerà prevalentemente in due fasi. Nella prima fase verrà studiato il
coinvolgimento del recettore TRPA1 come bersaglio dei metaboliti dello stress ossidativo e
nitrativo in vari modelli animali di dolore e di infiammazione neurogenica. I modelli animali
di dolore includono la neuropatia diabetica, indotta mediante singola somministrazione di
streptozotocina, o la neuropatia associata all'uso di agenti chemoterapici, oxaliplatino o
cisplatino. Verrà anche valutato il possibile ruolo del canale TRPA1 nei modelli animali di
neuropatia periferica mediante legatura del nervo sciatico. Alla fine di ogni trattamento
verranno effettuati sugli animali vari test comportamentali. Come modelli animali di
infiammazione verranno prima definite nel topo wild-type le risposte acute (min) o croniche
(ore, giorni) mediate da infiammazione neurogenica. Successivamente, determineremo in
modelli murini di asma e BPCO se in topi knockout per specifici TRP l varie componenti
della risposta infiammatoria saranno ridotte. Per verificare il coinvolgimento del canale
TRPA1, gli stessi esperimenti verranno effettuati anche in presenza dell’antagonista
selettivo per tale recettore, HC-030031. In una seconda fase del progetto, attraverso
metodiche atte a dimostrare l'espressione della proteina (RT-PCR ed analisi
immunoistochimica), verrà indagata la presenza del recettore TRPA1 in varie linee cellulari
e colture primarie di cellule residenti in distretti non-neuronali, verranno ad esempio prese
in considerazione cellule residenti nelle vie aeree. Successivamente, sulle stesse cellule,
mediante esperimenti funzionali di “calcium imaging”, verrà valutata la risposta funzionale
di tali recettori in risposta a stimolazione con agonisti selettivi TRPA1 in presenza o meno
di pretrattamento con antagonisti selettivi del canale. Infine verrà valutato il possibile
coinvolgimento fisiopatologico del recettore canale TRPA1 nello sviluppo della patologie
infiammatorie a carico dell’apparato respiratorio.
Prof. Pierangelo Geppetti
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