specie reattive dell`ossigeno
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BIOPHYSICS RESEARCH srl SPECIE REATTIVE DELL’OSSIGENO (Estratto dal testo l’”Ossigeno” del Dott. Siro Passi, Direttore del Centro Invecchiamento Cellulare dell’IDI IRCCS) – TESTO DA PRESENTARE IN MODO MOLTO SINTETICO ! Specie reattive dell’ossigeno (ROS: reactive oxygen species). La riduzione tetravalente (4 elettroni) dell’O2 a H2O, come avviene normalmente nei mitocondri, produce un alto potenziale positivo (E° = + 0,82 V a pH = 7 e 25°C). La riduzione monovalente (ad 1 elettrone) genera 4 specie reattive: l’anione radicale superossido (O2¯), il peridrossil radicale (HO2¯), il perossido di idrogeno o acqua ossigenata (H2O2) e l’idrossil radicale (HO•), i cui potenziali redox variano in soluzioni acquose a seconda del pH. Più alto e positivo è il potenziale redox, più alto è il potere ossidante della specie reattiva: l’HO° ha un potenziale E° talmente elevato da poter ossidare virtualmente tutte le biomolecole note. E’ importante sottolineare che la terminologia “specie reattive dell’ossigeno” è stata negli ultimi tempi preferita al più comune “radicali dell’ossigeno” in quanto H2O2, 'O2, HClO non sono radicali, non avendo elettroni spaiati sull’orbitale esterno. Dall’altro canto però anche l’aggettivo “reattivo” è un termini usato in senso relativo: O2 è più reattivo dell’ossigeno, ma molto meno di HO° o di 'O2. ANIONE RADICALE SUPEROSSIDO O IONE SUPEROSSIDO (O2). Nel 1968, in seguito alla scoperta da parte di McCord e Fridovich della superossidodismutasi (SOD), è stato proposto che la formazione dello ione superossido (O2) sia il maggior fattore di tossicità dell’ossigeno e che la SOD, che catalizza la reazione di dismutazione dell’O2 in perossido di idrogeno (H2O2) e O2, rappresenti la miglior difesa nei suoi confronti: O2 + O2 + SOD 2H + H2O2 + 3O2 A titolo di curiosità, è stato riportato che la superficie di Marte contiene ossigeno come complesso superossido, stabile in assenza di H2O. La dismutazione avviene più rapidamente a pH acido (protonazione dell’O2) che a pH più alto (verso l’alcalinità). Agendo come base debole, l’O2 in soluzioni acquose è un agente riducente, cioè dona elettroni. O2 può agire anche da debole agente ossidante (accettore di elettroni): 2H+ Fe2+ + O2 Fe3+ + H2O2 Può ossidare lentamente molecole con gruppi tiolici1 quali il glutatione ridotto, lo NADH legato al sito attivo della lattatodeidrogenasi (ma non NADPH o NADH liberi o legati ad altre deidrogenasi), l’acido ascorbico e i difenoli (orto e para difenoli). Tioli o tialcoli: composti organici caratterizzati dal gruppo solfidrilico –SH. Sono più acidi degli alcoli, di odore nauseabondo e facilmente ossidabili. 1 pg. 1 BIOPHYSICS RESEARCH srl Generazione di anioni superossido. Nelle cellule aerobiche, le più importanti fonti di anioni superossido sono le catene di trasporto elettronico dei mitocontri e del reticolo endoplasmatico. b1 a) - Mitocondri. Per ogni 4 elettroni che pervengono al sistema citocromo ossidasi, 1 molecola di O2 viene ridotta a 2 molecole di H2O con generazione di 3 molecole di ATP (Fig. 2 ) E-FADH2 O2 NADH 2e - O2 NADH CoQreduttasi pool del CoQ ee- CoQH2-cit creduttasi cit c citocromo ossidasi NAD+ H2O 3 ATP 2 - PL PUFA SOD - "leakage" di e - O2 e- + 2 H+ H2O2 e- + H+ HO e- + H+ H2O catalasi, GSH-Px Fig.2 Catena del trasporto elettronico nei mitocondri. Il NADH (nicotinamide-adenin-dinucleotide) viene ossidato a NAD+ da un complesso multienzimatico noto come NADH-coenzima Q-reduttasi. Due elettroni passano al coenzima Q (CoQ10 o ubichinone ossidato) con formazione di un semichinone ed in fine di coenzima Q ridotto (CoQ10H2): il CoQ10 ossidato può ricevere elettroni anche da flavoproteine (FADH2) generate durante il ciclo di Krebs o dalla -ossidazione degli acidi grassi. Dal CoQ10H2 gli elettroni passano, in virtù del sistema multienzimatico CoQH2-citocromo c-ossidoreduttasi, al citocromo c ossidato, che si riduce e viene successivamente ossidato da un altro sistema multienzimatico, la citocromo-ossidasi. Alcuni componenti della catena di trasporto elettronico, in particolare il sistema NADH-CoQreduttasi e le forme ridotte del CoQ10 possono “trasmettere” alcuni elettroni (“leakage”) direttamente all’ossigeno, provocando la riduzione univalente dell’ossigeno con generazione di O2, H2O2 e HO° (univalent pathway, univalent leak). Tale processo è incrementato da disaccopianti delle fosforilazione ossidativa, da trattamenti con ossigeno iperbarico, nelle fasi di ischemia-iperossia, dall’invecchiamento, da alterazioni dei lipidi mitocondriali riconducibili a deficienza di acidi polinsaturi (PUFA) o a fenomeni lipoperossidativi. Va tenuto in debito conto che fosfolipidi polinsaturi (PL-PUFA) sono presenti ad alte concentrazioni nei mitocondri, dove svolgono un ruolo importante sia al fine di mantenere le proteine dei sistemi multienzimatici nello stato conformazionale più idoneo al trasporto elettronico, sia per le interazioni positive con il pool del CoQ e gli altri fattori necessari per accoppiare l’ossidazione alla fosforilazione. In altre parole, se nei mitocondri venisse a mancare il corretto apporto di PL-PUFA per deficit di acidi polinsaturi o per eccesso di acidi grassi saturi, la catena respiratoria comincerebbe a funzionare male e l’ossigeno molecolare andrebbe incontro ad una significativa riduzione ad un elettrone. pg. 2 BIOPHYSICS RESEARCH srl Reticolo endoplasmatico. Il reticolo endoplasmatico di molte cellule animali (soprattutto delle epatiche) e vegetali contiene citocromi2 noti collettivamente come citocromo P-450 poichè le forme ridotte dei citocromi si complessano con ossido di carbonio (CO) producendo una specie che assorbe fortemente a 450 nm. Una delle funzioni principali del cit. P-450 è quella di ossidare un substrato a spese dell’O2. Un atomo di ossigeno va nel substrato, mentre l’altro forma acqua. Substrati per il cit. P-450 sono un gran numero di composti chimici, quali insetticidi e pesticidi (aldrin), idrocarburi (benzopirene) e molecole come paracetamolo, amfetamine, aflatossine e numerosi altri prodotti xenobiotici. I substrati idrossilati sono di solito meno tossici dei composti di partenza, ma non sempre, come suggeriscono le evidenze relative ai cataboliti del paracetamolo, delle aflatossine e di idrocarburi carcinogeni. Alcuni composti aumentano la sintesi di una o più forme di citocromo quando vengano somministrati ad animali. Uno di questi induttori è il fenobarbital, la cui idrossilazione ne aumenta la solubilità e quindi l’escrezione. La stessa cosa vale per l’etanolo: l’aumentata sintesi di specifiche forme di cit. P-450 rende più efficace l’ossidazione dell’etanolo e di altri alcoli. Durante il processo respiratorio mitocondriale, la NADPH - cit. P-450-reduttasi può indirizzare un’aliquota di elettroni sull’O2 producendo O2. Anche gli intermedi ossigenati dello stesso citocromo P-450 possono, decomponendosi, rilasciare O2. Nucleo: la membrana nucleare contiene un sistema di trasporto di elettroni che in presenza di NAD(P)H è capace di trasferire elettroni direttamente all’ossigeno. Ossidazione dell’emoglobina (Hb). Ciascuna delle 4 subunità proteiche (2 catene e 2 ) dell’Hb contiene un gruppo eme che lega reversibilmente una molecola di O2. Circa il 3% dell’Hb presente negli eritrociti è ossidata giornalmente a metaemoglobina, con relativo flusso di O2. I globuli rossi non hanno nuclei, nè mitocondri, nè possono sintetizzare proteine o lipidi di membrana e, sopravvivendo in media 120 giorni, debbono proteggersi contro gli ioni superossido ed altre specie reattive dell’ ossigeno utilizzando SOD (Cu-Zn-SOD), catalasi, glutatione perossidasi. SOD: Cu-Zn superossido dismutasi; CAT: catalasi; GSH-Px: glutatione perossidasi; GR: glutatione reduttasi; GSH e GS-SG: glutatione ridotto ed ossidato; MR: metemoglobina reduttasi; PP: ciclo dei pentoso fosfati. Autossidazione di molecole di interesse biologico. Numerose sostanze, quali gliceraldeide, forme ridotte della riboflavina e dei suoi derivati, catecolamine (adrenalina, noradrenalina, dopa, dopamina), tioli (cisteina, glutatione ridotto), cisteamina, tetraidropteridine, vitamina C, ecc., autossidandosi, formano O2. L’ossidazione dell’adrenalina e quella delle flavine ridotte sono state impiegate addirittura come fonti di superossido nell’analisi della SOD. Le tetraidropteridine agiscono come cofattori di ossigenasi quali fenilalamina- e tirosinaidrossilasi. E’ stato da noi dimostrato che la citotossicità aspecifica in coltura dei polifenoli, incluse le catecolamine, è dovuta non ad una loro incorporazione nelle cellule, con conseguente ossidazione da parte di enzimi intracellulari, ma ad ossiradicali generati dall’autossidazione accelerata dalla presenza di metalli di transizione nell’environment. 2 Citocromi: metalloproteine che sono contenute nei mitocondri delle cellule. Svolgono una funzione essenziale nella respirazione mitocondriale in quanto fanno parte della catena respiratoria come trasportatori di elettroni. pg. 3 BIOPHYSICS RESEARCH srl Fotossidazione ultravioletta (UV) di triptofano e melanine. Formazioni di ioni superossido si ottiene con l’esposizione del triptofano e della melanina alle radiazioni UV. Il triptofano è un costituente importante nelle proteine presenti nel cristallino, mentre le melanine (eumelanine e feomelanine) sono pigmenti formati dall’ossidazione e polimerizzazione della L-dopa o della L-dopa più tioli (feomelanine) contenenti alte concentrazioni di chinoni, semichinoni e difenoli. Enzimi. Sono numerosi gli enzimi presenti in cellule animali e vegetali capaci di generare O2. Perossidasi non specifiche (piante e batteri). Contengono generalmente Fe3+ nel loro sito attivo. Xantinaossidasi, presente nell’intestino, nel fegato, nei tessuti ischemici e probabilmente in molti altri tessuti animali e vegetali. La xantinaossidasi catalizza non solo l’ossidazione dell’ipoxantina a xantina ed acido urico (v. Fig.6), ma anche quella di altri substrati, quale l’acetaldeide, con produzione di O2. O O O N HN O2 N O , H O HN 2 2 HN xantinaossidasi N N Ipoxantina O NH +2H+ + 2O2- xantinaossidasi N I H N I H O Xantina N I H O N I H H2 O 2 Acido urico Fig.6. Presumibile meccanismo d’azione della xantinanossidasi Un potente inibitore della xantinaossidasi è l’allopurinolo, che viene ossidato ad ossipurinolo, il quale, legandosi al sito attivo dell’enzima, ne causa l’inibizione. Per questo l’allopurinolo è considerato un substrato “suicida” della xantinaossidasi. Anche preparazioni commerciali di acido folico contenenti, come contaminante, la pterinaldeide inibiscono l’enzima. Ischemia - riossigenazione. Abbiamo già riferito che un ruolo fondamentale dei mitocondri è quello di detossificare l’ossigeno, riducendolo ad acqua, per mezzo di sistemi multienzimatici. Il processo è intimamente legato alla produzione di energia (ATP). Peraltro i mitocondri, come già detto, generano un flusso di O 2: vari componenti allo stato ridotto (NADH, FADH2, CoQH2) presenti nella catena di trasporto elettronico possono donare una certa aliquota di elettroni direttamente all’ossigeno, con formazione di O2 .Il perchè di questa anomala cessione di elettroni non è noto. Tessuti resi ischemici/ipossici (concentrazioni di O2 inferiori alla norma) possono sopravvivere per un certo periodo di tempo, variabile da tessuto a tessuto; dopo questo periodo il danno diventa irreversibile e le cellule del tessuto muoiono. I muscoli scheletrici sono abbastanza resistenti (ore) all’ipossia, mentre per il cervello tale resistenza ha una durata di pochi minuti e per il cuore di 5060 minuti. I tessuti rispondono in vari modi all’ischemia: degradazione del glicogeno, glicolisi anaerobica (produzione di lattato e acidosi), caduta dei livelli di ATP con formazione di ipoxantina. Alla fine la pg. 4 BIOPHYSICS RESEARCH srl glicolisi si riduce e il danno alle membrane diventa apprezzabile al microscopio. E’ probabile che il danno mitocondriale evidenziato durante l’ischemia/ipossia dipenda dal periodo di carenza di O2 e dall’integrità dei meccanismi “scavenger”, poichè si generano specie reattive dell’ ossigeno. Se il periodo di ipossia/ischemia non si protrae a lungo, il tessuto può essere in gran parte salvato riperfondendolo con sangue e reintroducendo O2 e nutrienti. La riperfusione è un processo tutto sommato benefico, anche se McCord ha dimostrato che la reintroduzione di O 2 in un tessuto ischemico/ipossico può anche infliggere un ulteriore danno al tessuto (danno da riossigenazione o da riperfusione), che dipende dalla durata del periodo di ischemia/ipossia. Secondo tale autore, nel tessuto ischemico/ipossico c’è conversione da deidrogenasi ad ossidasi a causa di meccanismi proteolitici 2+ (proteasi attivate da Ca ) e/o ossidazione di gruppi SH. La riduzione di ATP nei tessuti produce accumulo di ipoxantina, con tutte le conseguenze che ciò comporta. b1 l) - Fagocitosi. Durante la fagocitosi, le cellule fogocitiche (neutrofili, macrofagi, monociti ed eusinofili) incrementano significativamente il consumo di O2 non legato alla respirazione mitocondriale; tale incremento è noto come “oxidative burst”. Il richiamo di ossigeno nelle cellule fagocitiche è dovuto all’attivazione della NADPH-ossidasi, un enzima complesso associato alle membrane plasmatiche, capace di ossidare il NADPH derivante + dal ciclo dei pentosi fosfati (nel citosol) a NADP ; gli elettroni riducono l’O2 a O2 NADPH + 202 NADP+ +H+ + 202 ********************** L’O2, a causa della sua carica, non è in grado di attraversare le membrane cellulari a meno che non ci sia uno specifico canale anionico, attraverso il quale esso possa muoversi. Un tale canale è stato suggerito negli eritrociti e nella membrana delle cellule dell’endotelio vascolare. ACQUA OSSIGENATA ( H2O2 ). La generazione di acqua ossigenata, che non è un radicale non possedendo elettroni spaiati, ha luogo attraverso la dismutazione dello ione superossido ad opera della superossido dismutasi (SOD) con una costante 1,6 x 109 M-1s-1 rispetto a quella della dismutazione non catalizzata ( 2 x 105 M1 -1 s , a pH neutro). 2 O2 + SOD H2O2 + O2 2H+ spontanea 2 O2 + 2H+ H2O2 + O2 Ogni sistema che genera superossido può produrre acqua ossigenata. Esistono comunque enzimi localizzati nei perossisomi (D-aminoacido ossidasi, glicolato ossidasi e urato ossidasi) che producono acqua ossigenata senza passaggio attraverso ioni superossido. E’ importante sottolineare che molecole xenobiotiche che stimolano la proliferazione dei perossisoni (clofibrato, nafenopina, di -(2-etilesil) ftalato, acido 2,4-diclorofenossiacetico, ecc.) inducono anche iperproduzione di H2O2. La formazione di lipofuscine nel fegato dopo esposizione prolungata pg. 5 BIOPHYSICS RESEARCH srl ad induttori della proliferazione di perossisomi costituisce una misura della lipoperossidazione causata da stress ossidativo (stato pro-ossidante). Ecco, allora, che tali induttori possono essere considerati, per ora solo negli animali da esperimento, quali iniziatori della carcinogenesi epatica. Al contrario dell’O2, l’H2O2 può penetrare facilmente nelle membrane cellulari e reagire con ioni di metalli di transizione, producendo idrossil radicali. Ci sono due enzimi capaci di rimuovere l’H2O2 intracellulare : la glutatione perossidasi (GSH-Px) e la catalsi (CAT), quest’ultima localizzata soprattutto nei perossisomi. L’H2O2 intracellulare può essere parzialmente rimossa per addizione di CAT esogena: questa infatti è capace di alterare l’equilibrio diffusivo tra H2O2 interna ed esterna, causandone l’uscita delle cellule attraverso le membrane. IDROSSIL RADICALE (HO°) Ci sono due principali criteri per generare HO° in vivo: 1) fotolisi dell’acqua, quindi esponendo l’acqua a radiazioni ionizzanti ad alta energia: si producono idrogeno atomico, idrossilradicali ed elettroni idratati, oltre a prodotti stabili quali idrogeno molecolare, perossido di idrogeno e protoni. Gli atomi di H, contenendo elettroni spaiati sono in realtà radicali idrogeno. Le radiazioni ultraviolette non sono così energetiche da formare HO° dell’H2O, sono in grado invece di generarli dall’H2O2: UV H2O2 HO° + HO° 2) Decomposizione o frattura metallo-dipendente dell’acqua ossigenata secondo lo schema H2O2 + Men+ Me(n+1) + HO° + HO in cui il Men+ è lo ione di un metallo di transizione (elemento della prima riga del blocco d della scala periodica): ferro2+, titanio3+, cobalto2+, rame1+ ecc.). La decomposizione dell’H2O2 Fe2+ dipendente è chiamata normalmente reazione di Fenton Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO + HO° Anche M Cu+ reagendo con H2O2 produce HO° (reazione di Haber-Weiss) Cu+ + H2O2 Cu2+ + HO + HO° + L’HO° è la specie più reattiva esistente in natura (emivita 0,3 ns) ed è estremamente mutageno. Esso reagisce con una costante di 2° ordine ( K2 ) pari a 108 - 1010 M-1 s-1 con quasi ogni molecola situata nei pressi dei suoi siti di formazione cosicché qualsiasi molecola presente ad alte concentra° zioni in una cellula può a ragione considerarsi uno scavenger di HO . Il DNA risulta essere un target importante dell’attacco dell’HO° in vivo e produce un’ampia varietà di by products, alcuni fra i quali 8-idrossiguanina (8-OHdG), sono stati usati come bioindicatori del danno ossidativo al DNA in cellule, tessuti e fluidi biologici. pg. 6 BIOPHYSICS RESEARCH srl OSSIGENO SINGOLETTO ( 'O2). Ossigeno singoletto si produce generalmente sia “in vitro” che “in vivo” attraverso reazioni di fotosensibilizzazione; numerose molecole, variamente pigmentate, allorchè vengono illuminate con radiazioni di determinata lunghezza d’onda , assorbono energia e passano ad uno stato eccitato, la cui energia di eccitazione può venire trasferita ad una molecola di ossigeno che viene eccitata a ‘O2, mentre le molecole fotosensibilizzate tornano al loro stato naturale (ground state). Molecole fotosensibilizzate sono gli psoraleni , le porfirine, la clorofilla a e b, il retinale, la bilirubina, la riboflavina e suoi derivati quali flavin mononucleotide e flavin dinucleotide, il blue di toluidina, il rosa di bengala, il blue di metilene, la tetraciclina, il benoxaprofen, alcuni componenti di cosmetici, ecc.. Portiamo alcuni esempi: OZONO ( O3 ). L’ ozono è presente nella stratosfera ove forma uno strato ( barriera di ozono ), ad una altezza compresa tra 15 e 35 km sopra la superficie terrestre e, in condizioni normali, viene continuamente generato tramite processi fotochimici e degradato ad opera sia di meccanismi naturali che indotti dall’ uomo. L’ ossido nitroso ( N2O ) generato dai batteri denitrificanti del suolo, diffonde nella stratosfera ove si combina con ossigeno atomico producendo ossido nitrico ( NO ) che distrugge l’ ozono formando diossido di azoto ( NO2 ): N2O + O NO O3 NO viene prodotto anche dalle esplosioni nucleari. Anche i cloro radicali generati dalla fotodissociazione dei clorofluorometani , noti anche come Freons, reagiscono con l’ ozono provocando perdite catalitiche della barriera. La barriera dell’ ozono assorbe quasi del tutto le micidiali radiazioni ultraviolette C (UV C), e buona parte delle radiazioni UV B, impedendo loro di raggiungere la superficie. Poiché la trasmissione delle UV B attraverso l’ atmosfera varia esponenzialmente con la concentrazione dell’ ozono, minime variazioni negative della barriera dell’ ozono comportano un incremento pericoloso della irradianza solare e delle radiazioni UV sulla superficie terrestre. E’ stato calcolato che una riduzione del 10 % dell’ ozono comporterebbe un aumento del 2-5 % dei carcinomi basocellulari cutanei. ACIDO IPOCLOROSO ( HClO ). L’ acido ipocloroso è un potentissimo ossidante che si genera nella fagocitosi (vedi). OSSIDO NITRICO (NO) . L’ NO ha un elettrone spaiato e può quindi, per definizione, è un radicale libero. Come tale reagisce facilmente con molecole paramagnetiche quali ossigeno, anioni superossido, radicali liberi in genere e ioni di metalli di transizione. Con l’ ossigeno in soluzione acquosa si forma nitrito: 4 NO + O2 +2 H2O 4NO2 +4 H+ In soluzioni alcaline ( pH 12-13 ) reagisce con anioni radicali dando anione perossinitrito stabile (OONO ), la cui presenza è verificata col marcatore 3-NT: NO + O OONO 2 A pH neutro il perossinitrito è parzialmente protonato ad acido perossinitroso, che rapidamente si decompone generando probabilmente radicali idrossilici e biossido di azoto: HONOO HO + NO2 pg. 7 BIOPHYSICS RESEARCH srl Il perossinitrito è un potente ossidante: a pH=7,0, i valori teorici per i potenziali redox sono di circa 1,2-1,4 V . Ossida i gruppi tiolici3 presenti nelle proteine in maniera più efficiente dell’ acqua ossigenata; è capace di idrossilare il benzene e di ossidare il dimetilsolfossido ( DMSO ) a pH acido e, verosimilmente, il DNA ed i PUFA con risultante citotossicità . In realtà, la tossicità dell’ acido perossinitroso è da attribuirsi alla sua decomposizione, a pH fisiologico, in HO + NO2 che non richiede la partecipazione dei metalli di transizione. Reattività dell’ ossido nitrico. Non è ancora del tutto stabilito che lo NO, come tale, sia in grado di estrarre 1 elettrone da un PUFA, innescando la lipoperossidazione. Di certo, esso può ossidare la Vit E ed altri fenoli con formazione di fenossi radicali. Lo NO è capare di reagire ( reazione di termine ) con radicali a vita breve, derivanti da svariati precessi degratativi a spese delle biomolecole : R R + NO RNO RNO alchil radicale R RS + tiil radicale NO RSNO tionitrito RO + NO RNO2 alcossi radicale alchilnitrito Lo NO reagisce con complessi di metalli di transizione ( M ) formando nitrosil complessi stabili MNO, ciascuno dei quali può manifestare comportamenti chimici differenti, poiché l’ ossido nitrico è presente sia in forma radicale neutra ( NO ), che anionica ( NO - ), che cationica ( NO + ): [ M (n-1 ) , NO + ] [ M ( n ) , NO ] [M (n+1 ) , NO- ]. Così, mentre l’ ossido nitrico come tale è un radicale libero con deboli proprietà nucleofile ed elettrofile, l’ossido nitrico coordinato le può mostrare entrambe , generando sia NO + ( ione nitrosonio ) che NO- (nitrossil anione ), per perdita o acquisto di elettroni, rispettivamente. L’ acido nitroso (HNO2) costituisce la forma protonata di NO2-: è un acido debole (pKa=4.7); a pH fisiologico NO2è quindi la specie predominante e può decomporsi rapidamente per dimerizzazione e deidratazione producendo ossido nitroso (N2O). La sua natura chimica, propende comunque alla perdita dell’elettrone in eccesso con rigenerazione di NO, con l’elettrone che viene captato da O2, flavine e metalli di transizione allo stato ossidato (Fe 3+ ) presenti in proteine. Lo NO- viene descritto come potente vasorilassante. La conversione di NO a NO+, forte agente nitrosante, richiede alti potenziali redox: è stato suggerito che si formi durante l’ossidazione di NO con O2 e questo spiegherebbe perché solo in condizioni aerobiche si ha la nitrosazione di residui tiolici, aminici etc delle proteine. Il processo è reversibile e può avere importanti implicazioni in termini di regolazione di attività enzimatiche NO dipendenti. Lipton ed altri hanno dimostrato che in funzione del suo stato redox, lo NO può esplicare effetti paradossi: ad esempio può svolgere una azione neuroprotettiva e al tempo stesso viene implicato nella distruzione neuronale in seguito a “stroke” vascolare ( colpo apoplettico ). Tioli o tialcoli: composti organici caratterizzati dal gruppo solfidrilico –SH. Sono più acidi degli alcoli, di odore nauseabondo e facilmente ossidabili. 3 pg. 8 BIOPHYSICS RESEARCH srl L’attività neurotossica è attribuibile alla forma radicale neutra (NO), che reagendo con O2- produce perossinitrito, verosimilmente l’agente neurotossico, mentre gli effetti neuroprotettivi sono dovuti alla forma cationica NO+, che reagisce con i gruppi tiolici del recettore N-metil-D- aspartato ( NMDA), bloccando in tal modo la neurotrasmissione. Da tale punto di vista, terapeuticamente valide dovrebbero essere quelle molecole in grado di inibire la formazione di NO e di incrementare quella di NO+, tenendo però conto che anche un eccessiva azione nitrosante può avere effetti indesiderati. Generazione di NO. NO possono essere generati in vivo da NO-sintetasi ( NOS ) o rilasciati da composti sintetici, utilizzati in alcuni casi come agenti terapeutici a causa del loro potere vasorilassante. Ci sono due forme di NOS : una costitutiva regolata da Ca 2+ e calmodulina ed un’ altra citochine-inducibile regolata post-trascrizionalmente. Entrambe richiedono NADPH e O2 quali substrati e contengono nel gruppo prostetico un ferro protoporfirinico IX equivalente a quello del citocromo P-450. Le due forme di NOS sono a localizzazione citoplasmatica, anche se recentemente è stata trovata una ROS costitutiva endoteliale associata alle membrane. Esse catalizzano l’ossidazione della l-arginina ad NO + citrullina, attraverso la formazione di un intermedio: la N-idrossiarginina. Aspetti biologici e clinici dell’ NO L’NO è sintetizzato da numerose cellule, incluso le endoteliali, ed è coinvolto in numerosi processi fisiologici, cha vanno dalla vasodilatazione alla regolazione del tono vascolare, dall’ inibizione dell’ aggregazione piastrinica alla trasmissione neuronale alla citostasi. Le concentrazioni di NO sono sottoposte a regolazione e situazioni in cui esse sono o troppo basse o troppo alte possono comportare effetti deleteri. In tessuti in cui l’ NO controlla il tono vascolare, ridotti livelli possono comportare ipertensione polmonare e aggregazione piastrinica. Alti livelli sono invece coinvolti nell’ ipotensione associata a shock endotossici, danni tissutali conseguenti a risposte infiammatorie, mutagenesi e distruzione neuronale in seguito a colpo apoplettico. Nel primo caso sono indicati generatori di NO, nel secondo appaiono di una certa utilità gli inibitori di NOS . Vasodilatazione. I nitro-vasodilatatori quali nitroglicerina , sodio nitroprussiato ecc., generano NO, che tramite l’ attivazione della guanilato ciclasi e la conseguente sintesi e accumulo di GMP ciclico( cGMP ), media il rilassamento della muscolatura liscia della parete vasale. Anche l’ acetilcolina provoca un simile effetto rilassante : essa stimola le cellule endoteliali a produrre un messaggero, noto inizialmente come “ endotelium derived relaxing factor” ( EDRF )e successivamente identificato con l’NO, attraverso l’ attivazione di NOS Ca 2+ - calmomodulina dipendente, L’NO diffonde all’ esterno delle cellule e raggiunge la muscolatura liscia vascolare ove attiva la guanilato ciclasi e la sintesi di cGMP con conseguente rilassamento muscolare. L’NO incrementa la sintesi di CGMP anche nelle piastrine con conseguente aumento della loro aggregazione e della loro adesione alla superficie endoteliale vascolare. Viene generalmente riportato che una normale pressione ematica richiede la continua sintesi di NO nelle cellule endoteliali vascolari. Nelle malattie cardiovascolari la sintesi non è però sufficiente a ridurre la vasocostrizione e l’ipertensione e quindi viene richiesta pg. 9 BIOPHYSICS RESEARCH srl Neurotrasmissione. L’ NO costituisce uno dei principali neurotrasmettitori nel sistema nervoso centrale e periferico intervenendo nel rilassamento intestinale durante la peristalsi, nell’ erezione del pene, nell’ azione del glutammato sui livelli cerebrali del CGMP, nella memoria, nei danni neurodegenerativi di varia origine. E’ stato riportato che la maggior parte della neuroni iper-stimolati, di glutamato, che agendo tramite i recettori NMDA di neuroni adiacenti, causano la morte dei neuroni. L’ attivazione di tali recettori innesca un forte afflusso di Ca 2+ nei neuroni, che in associazione alla calmodulina attiva la NOS costitutiva; l’ ossido nitrico diffonde nei neuroni adiacenti e li uccide. Paradossalmenle, come si è già osservato, l’NO può anche svolgere effetti neuroprotettivi. Citotossicità. La stimolazione dei macrofagi tramite molecole quali -interferone, interleuchine, tumor necrosis factor, polisaccaridi ecc. induce la trascrizione del gene per una NOS in grado di sintetizzare cospicue quantità di NO anche in assenza di Ca 2+ . L’NO diffonde raggiungendo le cellule adiacenti dove reagisce con i centri Fe-S di numerose biomolecole ( ad esempio i complessi I e II della catena respiratoria ) ed inibisce la ribonucleotide reduttasi e quindi la sintesi del DNA e proliferazione cellulare. SEQUESTRATORI DI METALLI DI TRANSIZIONE. E’ ben noto che gli elementi della prima riga del blocco d della scala periodica (o elementi di transizione), con l’esclusione dello zinco, sono di fatto radicali liberi, in quanto posseggono elettroni non appaiati sugli orbitali esterni ( Fig.11. ) Elemento Numero atomico Scandio ( SC ) 21 Titanio ( Ti ) 22 Vanadio( V ) Cromo ( Cr ) 23 Manganese ( Mn ) 25 Ferro ( Fe ) 26 Cobalto ( Co ) 27 Nichel ( Ni ) 28 Rame ( Cu ) 29 Zinco ( Zn ) 30 Configurazione elettronica 24 1s2 2s2 2p6 3s2 3p6 3 Fig.11. d 4 s Configurazione elettronica degli elementi della prima rida del blocco d della scala periodica. Particolare interesse biologico rivestono ferro (Fe) e rame (Cu), presenti mediamente nell’organismo umano in quantità di 4,5 g e 0,08 g rispettivamente. Nel sito attivo di numerosi enzimi, Fe e Cu agiscono da eccellenti catalizzatori di reazioni di ossidazione a causa della valenza pg. 10 BIOPHYSICS RESEARCH srl variabile, che permette loro la perdita o l’acquisto di un singolo elettrone. Il problema sta nel fatto che tali metalli, allo stato libero, nella forma di ioni ridotti (Fe2+ e Cu+) sono ottimi catalizzatori di reazioni ossidative e possono facilmente accelerare le reazioni di ossidazione e rapidamente generare, in presenza di H2O2, i radicali più reattivi e mutageni esistenti in natura, vale a dire, gli idrossil radicali (HO°) (reazione di Fenton). Due terzi circa del ferro nell’organismo umano si ritrova nell’emoglobina, mentre il restante 1/3 risulta distribuito tra emoglobina, vari enzimi e proteine “carriers” quali transferrina, lattoferrina, emosiderina e ferritina. Nel plasma umano il ferro viene essenzialmente trasportato dalla transferrina, una glicoproteina con due siti ai quali il Fe3+ si lega saldamente a pH fisiologico. La capacità legante della transferrina eccede di gran lunga livelli di ferro totale plasmatico, che in realtà viene trasportato da circa il 25 - 30% della transferrina. Questo sta ad indicare che la quantità di ferro plasmatico libero, cioè non legato, è praticamente nulla. Al bisogno, la transferrina entra per endocitosi mediata da recettori nelle cellule che necessitano di ferro. Si forma un vacuolo citoplasmatico dal quale il ferro è rilasciato a pH acido (< 5,6), chelato da costituenti cellulari quali citrato, ATP, GTP, proteine particolari ecc. e quindi utilizzato. L’apotransferrina, cioè la transferrina senza ferro, viene quindi espulsa dalle cellule. Simili considerazioni possono estendersi alla lattoferrina, che lega 2 moli di Fe3+ per moli di proteina e si ritrova nel latte e in altri fluidi biologici ed è prodotta dalle cellule fagocitiche. In condizioni normali, il ferro trasportato da transferrina e lattoferrina non può intervenire nelle reazioni tipo Fenton per generare idrossil radicali, che si possono comunque formare se il ferro viene rilasciato dalle proteine, ad esempio in seguito ad una riduzione del pH. Generalmente il ferro in eccesso sui fabbisogni metabolici viene depositato in un altra proteina, la ferritina, che si può quindi considerare un sistema di deposito, nel quale la preteina, a mo’ di conchiglia racchiude un “core” metallico di circa 4500 ioni Fe3+ per molecola di proteina. Da notare che il ferro entra nella ferritina come ioni Fe2+,che vengono successivamente ossidati a Fe3+ e depositati nel “core” della proteina. La ferritina costituisce un deposito sicuro di ferro: non è capace cioè di generare idrossil radicale. In ogni caso il ferro può venir rimosso dalla ferritina per mezzo di agenti riducenti quali acido ascorbico, cisteina, ecc., che però devono entrare nella proteina e venire in contatto con il “core” metallico. Anche lo ione superossido (O2), in alte concentrazioni, è in grado di rilasciare ioni di ferro della ferritina, soprattutto quelli più esterni, rendendoli disponibili per la produzione di idrossil radicali. Se si rende necessario il deposito di grandi quantità di ferro, la ferritina può essere convertita, mediante un processo implicante reazioni radicaliche, in un altra proteina insolubile in acqua: la emosiderina, che deve considerarsi un sistema di deposito non catalitico e sicuro del metallo. La conversione di ferritina in emosiderina si riscontra di norma nei lisosomi ed è probabilmente mediata da un attacco proteolitico. Il rame viene essenzialmente trasportato nel plasma dalle ceruloplasmina, una proteina intensamente colorata in azzurro, che contiene 6-7 ioni rame/molecole e li rende non disponibili per le reazioni tipo - Fenton. Gli eventuali piccoli livelli di rame non sequestrati dalla ceruloplasmina, circolano legati verosimilmente all’albumina, ed in tale forma possono reagire con l’H2O2 formando idrossil radicali, che però non provocano eccessivi danni in quanto reagiscono direttamente con l’albumina, che rappresenta un potente sistema di difesa contro il danno da radicali e viene definita generalmente come “sacrifial antioxidant”. La difesa operata dall’ albumina è ascrivibile all’alta concentrazione di gruppi -SH (0,3-0,5 mM), capaci di agire da “scavengers”4 contro un ampia gamma di radicali e specie reattive ossidanti, incluso gli idrossil radicali, eventualmente generati dal rame. L’albumina danneggiata viene facilmente rimossa dal circolo e rimpiazzata da quella neo-sintetizzata al bisogno. 4 Ripulitori di........., quindi antiossidanti. pg. 11 BIOPHYSICS RESEARCH srl La ceruloplasmina è in grado di ossidare il Fe2+ e Fe3+ facilitando l’incorporazione degli ioni ferrici nella transferrina, e senza formazione di specie reattive; ma mostra anche proprietà antiossidanti in quanto capace di inibire le reazioni radicaliche Fe2+ dipendenti. In conclusione, in condizioni normali, ferro e rame non sono presenti in forma libera nel plasma e nei tessuti, tali da innescare reazioni radicaliche incontrollate ed indesiderabili: essi normalmente risultano o legati a proteine “carriers” o immagazzinati in proteine di deposito. Comunque è importante sottolineare che qualora i tessuti siano alterati o comunque danneggiati, ferro viene liberato dalle cellule o in forma libera o come emoproteine (ad esempio, mioglobina) o come ferritina o come “non transferrin bound iron “ ( NTBI ). Le emoproteine, oltre al ferro libero, sono significativamente implicate nei processi radicali e lipoperossidativi. Alte concentrazioni di ferro libero si ritrovano nelle cellule danneggiate di alcune aree cerebrali (substantia nigra, globus pallidus, organi circumventricolari....), che diventano pertanto facilmente prone a stress ossidativo, a causa degli alti livelli di acidi polinsaturi nelle membrane e di vit. C nella materia grigia e bianca e della ridotta concentrazione di antiossidanti sia nelle suddette che nelle altre aree cerebrali. Esistono malattie ereditarie congenite quali la emocromatosi e la -talassemia major (morbo o anemia di Cooley ) nelle quali esiste un sovraccarico di ferro; in altre parole il ferro plasmatico sopravanza la capacità saturanti della transferrina. Nella prima viene meno il sistema di controllo di assorbimento intestinale del ferro, che viene quindi assorbito in quantità molto maggiori. Occorrono comunque circa 40 anni perchè la malattia si sviluppi pienamente. Il ferro in eccesso può circolare legato all’albumina, al citrato o ad altre molecole, con il fegato in particolare che lo rimuove dalla circolazione sovraccaricandosi ed andando incontro ad epatopatie incluso epatomi. Danni possono anche colpire il cuore (malfunzioni cardiache), le cellule del pancreas (diabete), la pelle (pigmentazione cutanea), le articolazioni (infiammazione, artrite reumatoide) ecc.. Nel morbo di Cooley, le continue trasfusioni di eritrociti comportano accumulo di ferro libero nel fegato, milza ed anche cuore con conseguenti danni per questi organi. SPECIE REATTIVE DELL’ OSSIGENO ED ALTRI RADICALI. Specie reattiva Emivita Idrossil radicale ( HO ) 0,3 ns - Anione superossido ( O2 ) Ossigeno singoletto ( 1O2 ) Acqua ossigenata ( H2O2 ) Ossido nitrico ( NO ) Ipoclorito ( ClO ) Alchil radicale ( R ) Alcossi radicale ( RO ) Alchilperossiradicale ( ROO ) Idroperossid lipidico ( ROOH ) Elettroni idratati ( e ) Atomo di idrogeno ( H ) Ascorbil anione radicale -tocoferil radicale Ubisemichinone radicale Radicali semichinonici della melanina 0,4s - 1,0 ms s - ms persistente s persistente ns s 1-10 s persistente 3,7 ns 9 ns s s ore persistenti pg. 12 BIOPHYSICS RESEARCH srl DIFESE PRIMARIE Antiossidanti enzimatici: Superossido dismutasi: converte lo ione superossido in acqua ossigenata. Catalasi: trasforma l’acqua ossigenata in acqua ed ossigeno. Glutatione perossidasi: agisce come la catalasi ed inoltre riducono gli idroperossidi ad alcoli. Sequestratori di metalli Ferritina, transferrina, lattoferrina: sequestrano ioni ferro. Ceruloplasmina: sequestra ioni rame. DIFESE SECONDARIE Vit. E: agisce da “ chain breaking antioxidant” Ubichinolo ( Co10QH2 ): agisce come la Vit.E. -carotene: potente scavenger dell’ ossigeno singoletto. Acido urico: scavenger di idrossil radicali. Glutatione ridotto, tioli, Vit. C, albumina ecc: scavengers di ROS e di altri radicali . pg. 13
