Metodi di identificazione e quantificazione:
Metodi immunoenzimatici
Daniela Mattei
Mara Stefanelli
I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI:
IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIO
Istituto Superiore di Sanità – Roma Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria
Roma 15 novembre 2007
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Principio
9 identificazione di un particolare anticorpo
mediante legame con antigene specifico
9 evidenza del complesso antigene-anticorpo
indice della presenza dell'anticorpo cercato
9 reazione semi-quantitativa
Steps
9
9
9
9
9
Antigene (analita) adsorbito su superficie del sistema (‘sorbent’).
Antigene riconosciuto dall’anticorpo specifico (‘immuno’)
Anticorpo riconosciuto da un secondo anticorpo marcato con
enzima (‘enzyme-linked’).
Reazione enzima-substrato con produzione di un complesso,
generalmente colorato
intensità del segnale (risposta) semi proporzionale alla quantità di
antigene (analita) inizialmente presente
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Diretto
antigene viene direttamente adeso
alla base solida (pozzetto)
seguito da un anticorpo
direttamente marcato con un
enzima
Indiretto
antigene direttamente adeso alla base
solida
anticorpo primario non marcato
aggiunto anticorpo secondario
marcato, specifico contro quello
primario
Un tipico KIT ELISA commerciale
strips, in forma di piastre da
96 pozzetti, con anticorpo
adeso sul fondo
Controllo negativo
Calibratori a concentrazioni (in ppb)
diverse
Diluente
Coniugato
Soluzione di lavaggio
Substrato
Soluzione Stop
Alcuni saggi ELISA per la
determinazione di tossine da
cianobatteri
Microcistine
Nodularine
Anatossina-a
Cilindrospermopsine
Saxitossine
Metodo ELISA competitivo
per la determinazione di microcistine in campioni di acqua
1.
preparazione del campione
aliquota (es. 100 ml) sottoposta a
congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi
cellulare e rilascio tossine
2.
allestimento dei pozzetti:
n. 2 pozzetti per ciascun campione
n. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento
diluente in ciascun pozzetto
analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto
3.
reazione di competizione:
campione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico
per l’analita
antigene (campione) compete con l’antigene immobilizzato nel
legare l’anticorpo
incubazione (t ambiente, 30 min)
lavaggio: rimozione dei complessi antigene-anticorpo in
soluzione
Metodo ELISA competitivo
per la determinazione di microcistine in campioni di acqua
4.
legame del complesso marcato anticorpo-enzima:
inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima
che va a legarsi all’anticorpo primario
lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione
5.
reazione cromogenica:
addizionato un reagente incolore che genera una reazione
colorimetrica prodotta dall’enzima legato al complesso
antigene-anticorpo immobilizzato sul substrato
incubazione (t ambiente, 30 min)
reazione inibita mediante addizione di reagente acido
6.
dosaggio:
lettura spettrofotometrica
intensità di colore inversamente proporzionale alla
concentrazione di analita
concentrazione incognita ottenuta per interpolazione su una
funzione assorbanza/concentrazione di analita ottenuta con
materiali di riferimento
Conc. MC (log)
Metodo ELISA per la determinazione di microcistine
disponibilità kit commerciali
sensibilità (LOD ca. 0.1 μg/L)
Ridotte quantità di campione (non trattato)
rapidità (ca. 3 ore / > 40 campioni)
accuratezza e precisione idonei allo scopo
disponibilità di anticorpi specifici per apteni
presenti sulla molecola di cianotossine
Vantaggi
aspecificità
costi
cross-reactivity (falsi +)
Svantaggi
Conclusioni
• saggi ELISA e PPi metodi di screening efficaci
e praticabili
• esperienza ISS
• materiali di riferimento:
– limitazioni di impiego
– costi
– limitati a poche tossine
• metodi di conferma: indispensabili per
effettiva valutazione del rischio
• aspettative da metodi molecolari
