Metodi immunoenzimatici - Istituto Superiore di Sanità

Metodi di identificazione e quantificazione:
Metodi immunoenzimatici
Daniela Mattei
Mara Stefanelli
I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI:
IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIO
Istituto Superiore di Sanità – Roma Dipartimento Ambiente e Connessa Prevenzione Primaria
Roma 15 novembre 2007
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Principio
9 identificazione di un particolare anticorpo
mediante legame con antigene specifico
9 evidenza del complesso antigene-anticorpo
indice della presenza dell'anticorpo cercato
9 reazione semi-quantitativa
Steps
9
9
9
9
9
Antigene (analita) adsorbito su superficie del sistema (‘sorbent’).
Antigene riconosciuto dall’anticorpo specifico (‘immuno’)
Anticorpo riconosciuto da un secondo anticorpo marcato con
enzima (‘enzyme-linked’).
Reazione enzima-substrato con produzione di un complesso,
generalmente colorato
intensità del segnale (risposta) semi proporzionale alla quantità di
antigene (analita) inizialmente presente
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Diretto
ƒ antigene viene direttamente adeso
alla base solida (pozzetto)
seguito da un anticorpo
direttamente marcato con un
enzima
Indiretto
ƒ antigene direttamente adeso alla base
solida
ƒ anticorpo primario non marcato
ƒ aggiunto anticorpo secondario
marcato, specifico contro quello
primario
Un tipico KIT ELISA commerciale
ƒ strips, in forma di piastre da
96 pozzetti, con anticorpo
adeso sul fondo
ƒ Controllo negativo
ƒ Calibratori a concentrazioni (in ppb)
diverse
ƒ Diluente
ƒ Coniugato
ƒ Soluzione di lavaggio
ƒ Substrato
ƒ Soluzione Stop
Alcuni saggi ELISA per la
determinazione di tossine da
cianobatteri
Microcistine
Nodularine
Anatossina-a
Cilindrospermopsine
Saxitossine
Metodo ELISA competitivo
per la determinazione di microcistine in campioni di acqua
1.
preparazione del campione
aliquota (es. 100 ml) sottoposta a
congelamento/scongelamento & ultrasuoni: lisi
cellulare e rilascio tossine
2.
allestimento dei pozzetti:
n. 2 pozzetti per ciascun campione
n. 2 pozzetti per ciascun materiale di riferimento
diluente in ciascun pozzetto
analita standard (antigene) immobilizzato sul supporto
3.
reazione di competizione:
campione inserito nel pozzetto insieme ad anticorpo specifico
per l’analita
antigene (campione) compete con l’antigene immobilizzato nel
legare l’anticorpo
incubazione (t ambiente, 30 min)
lavaggio: rimozione dei complessi antigene-anticorpo in
soluzione
Metodo ELISA competitivo
per la determinazione di microcistine in campioni di acqua
4.
legame del complesso marcato anticorpo-enzima:
inserimento nel pozzetto di un anticorpo marcato con enzima
che va a legarsi all’anticorpo primario
lavaggio: rimozione dei complessi in soluzione
5.
reazione cromogenica:
addizionato un reagente incolore che genera una reazione
colorimetrica prodotta dall’enzima legato al complesso
antigene-anticorpo immobilizzato sul substrato
incubazione (t ambiente, 30 min)
reazione inibita mediante addizione di reagente acido
6.
dosaggio:
lettura spettrofotometrica
intensità di colore inversamente proporzionale alla
concentrazione di analita
concentrazione incognita ottenuta per interpolazione su una
funzione assorbanza/concentrazione di analita ottenuta con
materiali di riferimento
Conc. MC (log)
Metodo ELISA per la determinazione di microcistine
disponibilità kit commerciali
sensibilità (LOD ca. 0.1 μg/L)
Ridotte quantità di campione (non trattato)
rapidità (ca. 3 ore / > 40 campioni)
accuratezza e precisione idonei allo scopo
disponibilità di anticorpi specifici per apteni
presenti sulla molecola di cianotossine
Vantaggi
aspecificità
costi
cross-reactivity (falsi +)
Svantaggi
Conclusioni
• saggi ELISA e PPi metodi di screening efficaci
e praticabili
• esperienza ISS
• materiali di riferimento:
– limitazioni di impiego
– costi
– limitati a poche tossine
• metodi di conferma: indispensabili per
effettiva valutazione del rischio
• aspettative da metodi molecolari