TEST DI
SCREENING
E CONFERMA IN
TOSSICOLOGIA
(sostanze d’abuso)
A cura di Giuseppe Dalmasso
Laboratorio di Analisi Chimico-Cliniche P.O. Imperia
ASL 1 Imperiese
PREMESSA
La competenza dei Laboratori di Patologia Clinica per quanto concerne l’identificazione di sostanze
d’abuso è limitata a campioni di provenienza umana.
Le motivazioni di tale tipo di indagine possono essere cliniche, epidemiologiche o medico-legali.
SOSTANZE DA DOSARE
Vista la loro rilevanza sociale e pericolosità viene suggerito di ricercare le seguenti classi di
sostanze d’abuso:
- OPPIACEI
- METADONE
- CANNABINOIDI
- COCAINA
- BENZODIAZEPINE
- MET/AMFETAMINE
- BARBITURATI
- ETANOLO
MATRICI BIOLOGICHE
URINA: è la matrice biologica di prima scelta nell’analisi delle sostanze d’abuso.
Il suo utilizzo presenta vantaggi quali:
a) Prelievo non invasivo
b) Possibilità di campionare grandi volumi
c) possibilità di analizzare sia le sostanze che i metabolici anche a diversi giorni
dall’assunzione
Vi è da mettere in evidenza che le analisi delle sostanze d’abuso nelle urine possono solo dare
un’indicazione della presenza o l’assenza di tale sostanza ad un definito valore soglia, ma non
danno alcuna indicazione sulla quantità di sostanza assunta o sul momento dell’assunzione.
SANGUE: può dimostrare solo una esposizione relativamente recente (poche ore dopo
l’assunzione) ed inoltre il prelievo è invasivo. Ha il vantaggio che il sangue, al contrario
dell’urina, non può essere soggetto a modificazione e/o adulterazioni.
SALIVA: è senza dubbio la matrice non convenzionale più comunemente utilizzata in
sostituzione del sangue per il monitoraggio di molti farmaci e per studi farmacocinetici e
farmacotossicologici. Il motivo per cui viene determinato un farmaco nella saliva è che la sua
azione farmacologia dipende dalla frazione di farmaco nel plasma non legata alle proteine
seriche: questa frazione è normalmente escreta dalla ghiandola salivare nella saliva. I vantaggi
nell’utilizzazione di questa matrice sono costituiti dalla non invasività del prelievo, dalla facilità
di prelievo ripetuti nel tempo e dalla possibilità di quantizzare la frazione libera del farmaco. Gli
svantaggi sono costituiti dalla necessità di tecniche analitiche sensibili per i farmaci presenti in
piccole concentrazioni, dall’alterazione della concentrazione salivare di un farmaco nei casi di
stimolazione del flusso salivare per la raccolta, dal rischio di contaminazione nelle
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somministrazioni orali, intranasali e nella variazione del pH salivare. Inoltre le concentrazioni
trovate non sono sempre correlabili a quelle plasmatiche e urinarie.
CAPELLI: negli ultimi anni l’analisi dei capelli per la ricerca di farmaci e dei loro metabolici
ha ricevuto moltissima attenzione, soprattutto a causa dei vantaggi rispetto a liquidi biologici
quali urine o siero. I farmaci e loro eventuali metabolici rimangono all’interno del capello per
un tempo indefinito, fornendo una finestra di rivelazione (da settimane a mesi) molto più ampia
rispetto a quella nel siero o urine, in cui la quantità di farmaco diminuisce rapidamente in un
periodo di tempo relativamente breve (da ore a giorni). Inoltre, la raccolta dei capelli è semplice,
non invasiva e ripetibile per eventuali conferme sui risultati. Il capello è una matrice stabile
indefinitivamente e molto difficile da manipolare al fine di adulterare il contenuto.
I vantaggi sono:
!"monitoraggio dei farmaci assunti
!"non invasività del prelievo
!"possibilità di differenziare consumatori leggeri, moderati e pesanti
!"possibilità di individuare l’uso passato del farmaco con effetti collatelari ancora in atto
!"difficoltà nell’adulterare la matrice
Gli svantaggi:
!" variabilità nella cinetica di incorporazione dei farmaci dovuta alla velocità di
crescita del capello, di produzione del sebo e del sudore, e dalla presenza di
melanina
!"contaminazione esterna (detergenti per il lavaggio del capello, tinture, nicotina)
!"mancanza di standard di riferimento
!"scarsa correlazione capelli/peli pubici o ascellari a causa di crescita più lenta e di
maggior contatto con il sudore.
TEST INIZIALI ( SCREENING )
Sono test che permettono di analizzare in tempi brevi numerosi campioni (solitamente urine) in
maniera economica, efficace e standardizzata.
Permettono di escludere senza un ulteriore approfondimento diagnostico, I campioni negativi,
identificando quelli che non contengono sostanze della classe in esame o quelli in cui la relativa
concentrazione è al di sotto di un valore soglia definito cut off.
Il valore soglia è una definizione operativa stabilita in modo da definire un campione negativo o
positivo.
E’ importante distinguere però il valore soglia dal limite di determinazione del metodo
(sensibilità) che è la più bassa concentrazione dell’analita che può essere determinata con
certezza.
Di norma il valore soglia è fissato ad un valore più alto del limite di sensibilità per superare
l’inconveniente dell’inprecisione del metodo vicino al limite di sensibilità.
In tabella 1 sono riportati i cut off proposti per i test iniziali per le analisi delle droghe d’abuso
nelle urine.
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Tabella 1. Concentrazione soglia nei test iniziali per la positività delle classi di sostanze nelle
urine
CLASSE DI SOSTANZA
OPPIACEI (1)
COCAINA METABOLITI
CANNABINOIDI
ANFETAMINE E ANALOGHI
BARBITURICI
BENZODIAZEPINE
METADONE
CUT OFF (ng/ml)
300
300
100
1000
500
500
500
(1) 25 ng/ml per il test immumologico specifico per la morfina libera
Le metidiche usate per i test iniziali sono generalmente di natura immunochimica:
!"RIA (radioimmunologiche)
!"EIA (immunoenzimiche)
!"FPIA (fluorescenza a luce polarizzata)
!"LIA (lattici ad inibizione di agglutinazione)
!"KIMS (interazione cinetica di microparticelle in soluzione)
Sia la tecnica RIA sia l’ EIA utilizzano come evento primario una reazione immunologica
antigene (aptene) anticorpo (policlonale o monoclonale) con formazione di un
immunocomplesso antigene-anticorpo la cui presenza e testimoniata da un rivelatore che è
diverso per le due tecniche.
Nel caso del RIA il rivelatore è un tracciante radioattivo nel caso dell’EIA è un enzima.
L’EIA può essere classificata in omogenea ed eterogenea.
!"EIA in fase omogenea
I metodi basati su tale principio non richiedono la separazione dei reagenti nelle due fasi libera e
legata una volta avvenuta la formazione dell’immunocomplesso, in quanto l’enzima presenta un
comportamento diverso a seconda che l’antigene o l’anticorpo siano legati o meno al proprio
immunoreagente.
E’ questo il caso dell’EMIT (Enzyme Multiplied-Immunoassay Technique) dove l’enzima
coniugato all’antigene viene inibito (o attivato) dalla reazione immunologica o per esclusione
del substrato o per un’alterazione conformazionale dell’enzima.
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La tecnologia CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immuno Assay). si fonda sulla tecnica del
DNA ricombinante.Il dosaggio è basato sull’enzima batterico beta-galattosidasi, geneticamente
diviso in due frammenti chiamati Enzima Accettore e Donatore.Si utilizza sempre la classica
reazione antigene-anticorpo, però in questo caso, l’anticorpo specifico in eccesso che non si è
legato all’antigene, reagisce con il frammento di enzima donatore coniugato con l’antigene a
formare il complesso anticorpo-antigene-enzima donatore. Il frammento di enzima donatore
coniugato con l’antigene che non si è legato all’anticorpo di lega all’enzima accettore a formare
l’enzima attivo che è in grado di reagire con un substrato specifico formando una molecola che
assorbe nel visibile e il cui assorbimento è proporzionale alla droga presente nel campione.
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!"EIA in fase eterogenea
A differenza del caso precedente, il comportamento dell’enzima non si modifica passando dalla
fase libera a quella legata, quindi le due fasi devono essere separate fisicamente al fine di
evidenziare l’avvenuta reazione.
A questo tipo appartiene la tecnica ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
che si basa sull’assobimento dell’antigene all’anticorpo legato ad una fase solida (superficie di
provetta, pozzetto, pallina di plastica ecc.) che consente così una facile separazione della
frazione libera da quella legata, mediante lavaggio.
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La metodologia EIA in fase eterogenea si differenzia poi in competitiva e non competitiva.
Nella tecnica competitiva si sfrutta sostanzialmente la competizione per i siti anticorpali fra
antigene (aptene) da dosare e antigene marcato introdotto come rivelatore; in quella non
competitiva si realizza una misura diretta della concentrazione antigenica in base alla quantità
di anticorpo marcato aggiunto in eccesso.
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La tecnologia FPIA si basa sul principio della fluorescenza a luce polarizzata.
Quando un fluoroforo oppure una molecola fluorescente vengono eccitati da luce di appropriata
lunghezza d’onda, essi assorbono una quantità d’energia ed entrano in uno stato di eccitamento.
Quando le molecole ritornano allo stato originario viene emesso un fotone di luce ad una
lunghezza d’onda diversa da quella di eccitazione : questo fenomeno viene chiamato
fluorescenza.
Se il fluoroforo viene illuminato da una luce polarizzata linearmente, le molecole correttamente
allineate assorbono la luce.
Ritornato allo stato iniziale, il fluoroforo emetterà linearmente la luce polarizzata. Se la
molecola non si è mossa durante la sua vita allo stato eccitato, la fluorescenza presenterà una
polarizzazione completa in caso contrario la polarizzazione sarà ridotta.
La perdita di polarizzazione è proporzionale alla velocità di movimento della molecola.
Durante l’analisi ad un’aliquota di campione del paziente si aggiunge un tracciante (composto
formato dall’analita in esame coovalentemente legato al fluoroforo). L’analita presente nel
campione del paziente e il tracciante competono per legarsi ai siti di legame localizzati
sull’anticorpo. Quelli che si legano rallentano la loro velocità di rotazione poiché uniti ad una
grossa molecola.
Il tracciante legato all’anticorpo continua ad essere fluorescente, ma impiega più tempo a
ruotare. Un valore di polarizzazione alto sta ad indicare che la soluzione contiene solo una
piccola quantità di analista non marcato, ossia dell’analita presente nel campione, un valore
basso indica che la soluzione contiene una grande quantità di analista non marcato, ossia di
analita presente nel campione del paziente.
L’esatta relazione tra polarizzazione e concentrazione viene determinata misurando la
polarizzazione di calibratori a concentrazione nota.
La tecnica LIA è una tecnica immunologica rapida a cut off.
In questo caso il sistema di reazione è costituito dall’antigene (aptene), l’anticorpo (antisiero) e
da un mezzo rivelatore costituito da un lattice sensibilizzato con l’antigene da determinare.
Mettendo a contatto il campione (solitamente urina) con l’antisiero specifico in presenza di
lattice sensibilizzato con l’antigene da determinare, l’assenza di antigene fa sì che l’antigene
adeso al lattice, trovando liberi i siti dell’anticorpo, formi un complesso antigene-anticorpo
adeso al lattice dando luogo ad agglutinazione e quindi segno di negatività. In caso di presenza
di antigene nel campione, sarà questo che si legherà all’anticorpo, impedendogli di legarsi al
complesso lattice-antigene e di dar luogoalle macro-particelle. In tal caso la miscela di reazione
si presenta omogenea e lattescente ed è in questo caso indice di positività.
In figura 40-1 sono riportati i due esempi di test LIA positivo e negativo relativi alla molecola di
HCG che funge da antigene (aptene).
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Anche la tecnica KIMS si basa su microparticelle sensibilizzate con la droga da determinare e un
antisiero specifico. In assenza di droga nel campione, l’anticorpo libero si lega alla droga coniugata
alle microparticelle, formando aggregati. In presenza di droga, quest’ultima compete con il derivato
della droga legato alle microparticelle per legarsi all’anticorpo libero. L’anticorpo legato alla droga
del campione non è più disponibile per l’aggregazione con le microparticelle, quindi viene inibita
la formazione di un reticolo di microparticelle. Se la reazione viene rilevata
spettrofotometricamente, in assenza di droga nel campione, man mano che la reazione di
aggregazione procede, aumenta la variazione di assorbenza. Al contrario, la presenza di droga nel
campione riduce l’aumento di assorbenza, in proporzione alla concentrazione di droga presente. Il
contenuto di droga viene determinato in rapporto a una concentrazione nota (cut off).
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ANALISI DI CONFERMA
Un campione risultato positivo nel test iniziale immonologico, se non verificato con un test di
conferma cromatografico, può essere contestato e non ha valore medico –legale.
Le analisi di conferma servono a verificare che non ci siano risultati falsi positivi dovuti alla non
specificità dei test iniziali.
I test di conferma devono essere specifici per il singolo analista, per ovviare alla non specificità
della maggior parte dei test immunologiciche che è per classi di sostanze, devono inoltre basarsi su
principi chimici e fisici diversi da quelli dei test di primo livello.
Devono avere sensibilità uguale o maggiore al valore soglia stabilito nei test di primo livello. Il
valore soglia dei test di conferma deve essere ad un valore più basso rispetto allo screening quando
deve essere confermatoli singolo farmaco o metabolica.
Tabella 2. Concentrazione soglia nei test di conferma per la quantizzazione dell singole sostanze
nelle urine.
CLASSE DI SOSTANZE
CONCENTRAZIONE
(ng/ml)
OPPPIACEI:
MORFINA (libera + coniugata)
MORFINA 3-GLUCURONIDE (1)
MORFINA 6-GLUCURONIDE (1)
6-MONOACETILMORFINA
(2)
CODEINA
COCAINA METABOLITI:
BENZOILECGONINA
ECGONINAMETILESTERE
(2)
CANNABINOIDI:
DELTA 9 TETRAIDROCANNABINOLOACIDO CARBOSSILICO
GLUCURONIDE del DELTA 9
TETRAIDROCANNABINOLO-ACIDO CARBOSSILICO
(2)
AMFETAMINE ED ANALOGHI:
AMFETAMINA
METAMFETAMINA
3,4 METILENDIOSSIMETAMFETAMINA (MDMA)
METILENDIOSSIAMFETAMINA (MDA)
BARBITURICI:
FENOBARBITAL
SECOBARBITAL
AMOBARBITAL
BENZODIAZEPINE:
7 AMMINOFLUNITRAZEPAM
NORDIAZEPAM
OXAZEPAM
METADONE:
2 ETILIDENE-1,5-DIMETIL-3,3-DIFENIL-PINOLIDENE
(EDDP)
(2)
11
300
300
150
30
500
500
1000
1000
500
500
500
500
500
500
300
(1) Metabolita presente nell’urina che può essere dosato tal quale oppureinsieme alla
Morfina in seguito ad un processo di idrolisi (acida o enzimatica) per rompere il legame con il glucuronide.
(2) Altro metabolita presente nell’urina
Poiché i test iniziali sono immunochimici, le conferme vanno effettuate con metodi
cromatografici.
Le metodiche cromatografiche che possono essere usate per le conferme sono:
a) gas-cromatografia (GC)
b) cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC)
Il gas-cromatografo può essere accoppiato ad uno spettrometro di massa (GC/MS).
Con la GC/MS si uniscono le caratteristiche separative peculiari della gas-cromatografia con la
specificità della spettrometria di massa.
L’accoppiamento con lo spettrometro di massa rendono il metodo estremamente affidabile, dal
momento che le sostanze vengono identificate in base al loro peso molecolare e/o ai frammenti
chimici che si originano per impatto con elettroni prodotti ad alta velocità, presenti nella
sorgente ionica dello spettrometro.
Attualmente i progressi tecnologici raggiunti, gli ingombri e i prezzi ridotti uniti alla facilità di
esecuzione, rendono la GC/MS la metodologia di elezione per la conferma delle sostanze
d’abuso.
E’ comunque possibile confermare la presenza delle sostanze d’abuso e dei loro metabolici nei
liquidi biologici anche in HPLC accoppiato ad un rivelatore elettrochimico, a fluorescenza od
UV.
Questa strumentazione è meno costosa rispetto ad una GC/MS e di più facile utilizzo
E perciò più diffusa nei laboratori di analisi.
Però in questo caso la rivelazione non si basa su di un metodo assoluto e può quindi essere
soggetta ad interferenze per la coeluizione di molecole estranee a quelle indagate. La
identificazione si basa anche sulla sensibilità ed esperienza dell’analista.
Una identificazione più certa dell’analita può essere ottenuta accoppiando l’HPLC con un
rivelatore ad assorbimento di luce ultravioletta a fotodiodi (diode array), che consente la
registrazione dell’intero spettro ultravioletto dell’eluato cromatografico.
L’accoppiamento della cromatografia liquida con la spettrometria di massa ha consentito di
affiancare ad un metodo di rivelazione ad elevata sensibilità, una tecnica preparativa a
temperatura ambiente che consente di analizzare anche sostanze tremolabili, idrofile quali sono
molti metaboliti di sostanze d’abuso (es. glucuronidi) evitando così tutte le procedure di idrolisi
e derivatizzazione richieste in GC.
Però la sensibilità inferiore rispetto alla GC/MS e la non standardizzazione rende ancora questa
tecnica non inseribile nei protocolli dei test di conferma.
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CONVALIDA DEI TEST DI SCREENING E CONFERMA
La convalida ha lo scopo di documentare le caratteristiche del metodo analitico per una
validazione obiettiva dei risultati.
A tale scopo deve essere approntato un dettagliato protocollo di analisi e deve essere avviato un
controllo di qualità interno (CQI), in modo da poter decidere se accettare o ripetere i risultati
delle analisi in tempo reale e una valutazione esterna di qualità (VEQ) che consente una
valutazione a posteriori dell’attendibilità analitica, utilizzando i risultati delle analisi eseguite
nei diversi laboratori che analizzano gli stessi campioni.
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BIBLIOGRAFIA
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sugli obiettivi raggiunti nel 1995. Presidenza del Consiglio dei Ministri, Dipartimento per
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Qualità in medicina di laboratorio. Biochimica Clinica 1997, 21 (4): 163-228.
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