DANNO CELLULARE Reversibile Irreversibile Morte Necrosi Apoptosi L’apoptosi viene definita “morte cellulare programmata “ o “ suicido cellulare” Perché la cellula si “suicida”? Ci sono due ragioni principali: Durante lo sviluppo embrionale la morte cellulare è necessaria quanto la mitosi • Riassorbimento della coda durante la metamorfosi del girino in rana • La formazione delle dita delle mani e dei piedi • La formazione delle appropriate connessioni tra i neuroni durante lo sviluppo embrionale. La morte cellulare programmata è necessaria per distruggere quelle cellule che rappresentano un pericolo per l’integrità dell’organismo Per esempio l’eliminazione di: o Cellule infettate con virus o Cellule del sistema immunitario o Cellule con danni al DNA (mutate) o Cellule tumorali Cosa spinge le cellule a morire ? Il bilancio tra: • Il rilascio di segnali positivi, necessari per la sopravvivenza (fattori di crescita) • ricevere segnali negativi quali: i livelli di ossidanti intracellulari il danno al DNA da ossidanti o altri agenti i raggi UV, X, ionizzanti i chemioterapici specifiche molecole che si legano a recettori che trasmettono messaggi di morte (Fas e TNF) APOPTOSI embriogenesi sviluppo fetale omeostasi tissutale malattie degenerative tumori APOPTOSI Caratterizzazione morfologica delle alterazioni che accompagnano la sofferenza cellulare 1800s Kerr, Wyllie e Currie definiscono la modalità di morte alternativa alla necrosi, definita “apoptosi”, deputata al controllo dell’omeostasi tissutale degli organismi 1964-66 1971 Saunders e Lockshin suggeriscono l’esistenza di una “morte cellulare programmata” durante la metamorfosi degli insetti Identificati alcuni geni coinvolti nel processo apoptotico, bcl-2, fas e p-53 1980-82 Si osserva la DNA fragmentation e viene identificata la caspasi3 1989-91 L’APOPTOSI E’ UNA FORMA DI MORTE CELLULARE CHE HA LO SCOPO DI ELIMINARE CELLULE NON DESIDERATE ATTRAVERSO L’ATTIVAZIONE DI UNA SERIE DI EVENTI COORDINATI E INTERNAMENTE PROGRAMMATI PORTATI AVANTI DA UN INSIEME SPECIFICO DI PRODOTTI GENICI. Modificazioni morfologiche associate al processo apoptotico Diminuzione delle dimensioni cellulari con addensamento degli organelli e mantenimento della loro integrità Condensazione della cromatina e successiva degradazione internucleosomale del DNA in frammenti multipli di 180 paia di basi Formazione di estroflessioni della membrana citoplasmatica (blebs) che si distaccano da questa formando i caratteristici corpi apoptotici Processo di fagocitosi dei corpi apoptotici da parte di macrofagi A) Apoptosi nel fegato nel corso di epatite; B) nella cute nel corso di un eritema A B Cellula leucemica vitale (A) e cellula apoptotica (B) Caratteristiche biochimiche dell’apoptosi Si tratta di un processo , che richiede espressione di geni specifici, finemente controllato dalla cellula (oncogeni e onco-soppressori) Taglio delle proteine; Formazione di legami crociati fra le proteine; Rottura del DNA (a livello internucleosomiale ad opera di endonucleasi); Ricognizione fagocitaria (fosfatidilserina). BASI AZOTATE adenina guanina Basi azotate + pentoso = nucleosidi Basi azotate + pentoso + fosfato = nucleotidi I nucleosomi sono le unità ripetitive della cromatina, ciascuna contenente 200 bp di DNA e due molecole di ciascun istone H2A, H2B, H3 e H4 Taglio ad opera di endonucleasi specifiche A) Controllo B) DNA laddering apoptosis C) necrosi Perché la definiamo morte cellulare programmata? Caenorabditis elegans • 1090 cellule somatiche • 131 vanno in apoptosi Studi condotti su C. elegans permisero di suddividere il processo apoptotico in 3 fasi: induzione; esecuzione; riconoscimento; fagocitosi. Studi condotti sul C. elegans hanno permesso di identificare un gran numero di geni dell’apoptosi, tali geni sono in grado di dare risposte stereotipate a stimoli diversi, e attualmente sono così raggruppati: Recettori di membrana (Fas /APO1/CD95, TNF, TRIAL) Adattatori (FAAD, APAF1, ced-4) effettori (caspasi, ced-3, endonucleasi) Modulatori (Anti-apoptotici come Bcl-2 e ced-9, proapototici come il Bax) inibitori (Crma, survivina) Induttori (p53, c-myc) Fagocitosi Come avviene l’apoptosi? Vie principali del processo apoptotico CD95L via estrinseca mediata dai recettori di morte CD95 FADD Procaspase-8 Danno al DNA c-FLIP Bid P-53 Bcl-xL Bax Bcl-2 Caspase-8 via intrinseca mediata dai mitocondri Truncated bid Procaspase-3 Cytochrome-c AIF Apoptosome Caspase-3 Apaf-1 Procaspase-9 Apoptotic substrates IAPs Smac/DIABLO Vie principali del processo apoptotico CD95L CD95 via estrinseca mediata dai recettori di morte FADD Procaspase-8 Danno al DNA c-FLIP Bid P-53 Bcl-xL Bax Bcl-2 Caspase-8 via intrinseca mediata dai mitocondri Truncated bid Procaspase-3 Cytochrome-c AIF Apoptosome Caspase-3 Apaf-1 Procaspase-9 Apoptotic substrates IAPs Smac/DIABLO Caspasi Cysteinyl aspartate proteinases cistein-proteasi che possiedono un sito attivo cisteinico e operano il taglio proteolitico dei loro substrati specifici a livello di residui di acido aspartico sono presenti in tutte le cellule animali in forma inattiva, come zimogeni inerti, composti da tre domini: un prodominio N-terminale e due domini p10 e p20 in relazione alla loro funzione e ai tempi di attivazione le caspasi vengono distinte in due gruppi principali: Caspasi iniziatrici Caspasi esecutrici CASPASI INIZIATRICI caspasi 8, 9 caspasi esecutrici CASPASI ESECUTRICI caspasi 3, 6, 7 • proteine coinvolte nella degradazione del citoscheletro • endoribonuleasi responsabili della frammentazione del DNA • proteine deputate alla trascrizione, duplicazione e riparazione del DNA Le caspasi esecutrici, come la caspasi-3, sono in grado di indurre l’attivazione di tutti quegli enzimi che sono responsabili delle modificazioni morfologiche a carico delle cellule Durante il processo apoptotico l’azione delle caspasi è strettamente regolata da due famiglie di proteine Inhibitor Apoptosis Proteins (IAPs) Proteine della famiglia del Bcl-2 IAPs CD95L Le IAPs svolgono un’azione di tipo inibitorio sulle caspasi CD95 Queste vengono indicate come HIAP1, HIAP2, XIAP, NIAP, Survivin e Livin. Tra queste, la XIAP, legandosi alla caspasi-3, inibisce entrambe le vie apoptotiche, intrinseca ed estrinseca. L’azione della proteina XIAP può essere inibita mediante legame con la proteina mitocondriale Smac/DIABLO FADD Procaspase-8 Danno al DNA c-FLIP Bid P-53 Bcl-xL Bax Bcl-2 Caspase-8 Truncated bid Procaspase-3 Cytochrome-c AIF Apoptosome Caspase-3 Apaf-1 Procaspase-9 Apoptotic substrates IAPs Smac/DIABLO La famiglia delle proteine del Bcl-2 Le proteine del Bcl-2 si dividono in tre gruppi in base a criteri di omologia di sequenza e di funzione: 1°gruppo: proteine antiapoptotiche (Bcl-2, Bcl-xL), presentano 4 brevi domini (BH1, BH2, BH3, BH4) e un dominio c-terminale idrofobico che costituisce il sito di ancoraggio al mitocondrio 2°gruppo: proteine proapoptotiche (Bax, Bad, Bcl-xs), mancano del dominio BH4 3°gruppo: proteine con attività proapoptotica (Bid, Bik), conservano inalterata una sequenza di 12-16 aa del dominio BH3 PROTEINE BCL-2 CD95L CD95 FADD Procaspase-8 le proteine Bcl-2 formano eterodimeri o omodimeri questi dimeri svolgeranno un’azione anti o pro-apoptotica, a seconda che prevalgano le proteine anti o pro-apoptotiche Danno al DNA c-FLIP Bid Bcl-xL P-53 Bax Bcl-2 Caspase-8 Truncated bid Procaspase-3 Cytochrome-c AIF Apoptosome Caspase-3 Apaf-1 Procaspase-9 Apoptotic substrates IAPs Smac/DIABLO L’azione delle proteine Bcl-2 è strettamente correlata all’attività di proteine regolatrici del ciclo cellulare quali la p53 p53 CD95L l’attivazione della p53 avviene in seguito alla sua fosforilazione in corrispondenza di un residuo di serina la p53 attivata blocca la progressione del ciclo cellulare nella fase G1 CD95 FADD Procaspase-8 Danno al DNA c-FLIP - Bid P-53 Bcl-xL Bax Bcl-2 Caspase-8 Truncated bid c Procaspase-3 Cytochrome-c la p53 attivata determina l’up-regulation di proteine pro-apoptotiche quali il Bax. AIF Apoptosome Caspase-3 Apaf-1 Procaspase-9 Apoptotic substrates IAPs Smac/DIABLO INDUZIONE DI APOPTOSI DA PARTE DI MOLECOLE CHE SI LEGANO A RECETTORI DI MEMBRANA TNF FasL Fas TNFR1 DD FADD TRADD Attivazione sequenziale delle caspasi APOPTOSI INDUZIONE DI APOPTOSI DA PARTE DI SEGNALI PROVENIENTI DAI MITOCONDRI Bcl-2, proteina codificata dall’omonimo gene che appartiene alla famiglia di geni ANTIAPOPTOTICI Apaf = fattore attivante le proteasi dell’apoptosi (=caspasi) Citocromo C + Apaf-1 + ATP Pro-caspasi 9 caspasi 9 Stimolo stressogeno p53 Variazione del potenziale di transizione di permeabilità APOPTOSI ___ Proteina codificata Bax dall’omonimo gene che appartiene alla famiglia di geni PRO-APOPTOTICI IAP = Proteine Inibenti l’Apoptosi VIA ESTRINSECA LIGANDO VIA INTRINSECA DANNO Attivazione recettore di morte Attivazione p-53 Legame con proteine adattatrici Trascrizione geni proapoptotici Rilascio citocromo-c Attivazione procaspasi 8 Attivazione procaspasi 9 Attivazione procaspasi 3 APOPTOSI Attivazione procaspasi 3 APOPTOSI