FONDO PER LA PROMOZIONE DI ACCORDI ISTITUZIONALI “Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema agricolo ad elevata sostenibilità ambientale” Approccio integrato nella ricerca di un sistema sostenibile di lotta al brusone del riso SISTEMI INNOVATIVI PER UNA GESTIONE SOSTENIBILE DELL'ACQUA IN RISAIA CENTRO RICERCHE SUL RISO 30 gennaio 2014 BRUSONE DEL RISO malattia fungina del riso più grave con una vasta distribuzione mondiale causato dal fungo anamorfo Pyricularia oryzae Cavara perdite senza fungicidi: circa il 7-10% in bassa presenza, fino al 40% per alta incidenza P. oryzae X1000 dal 2013 vietato l’uso di fungicidi contenenti triciclazolo, sostanza attiva molto efficace contro Pyricularia. Oggi registrate solo azoxystrobin e flutriafol (contenimento danni) sintomatologia più grave: pannocchia deperisce e secca in fase di fioritura La patologia si manifesta su foglie, sui nodi e i culmi Brusone fogliare Mal del collo epidemia aggravata da: condizioni meteo-climatiche (elevate escursioni termiche, rugiada mattutina, bagnatura fogliare, umidità), terreni carenti in sostanza organica o sabbiosi o limosi, eccessiva concimazione azotata maggior frequenza e intensità nelle provincie di Pavia e Milano per questi fattori + semina interrata a file su terreno asciutto + varietà tipiche da risotto, come Carnaroli, Vialone Nano, Arborio, tra le più suscettibili (Tabacchi 2011) LOTTA AL BRUSONE DEL RISO aumento della fertilizzazione azotata in risaia mancanza di una resistenza genetica nelle varietà tipicamente coltivate in Lombardia minor disponibilità di fungicidi dotati di diverso meccanismo d’azione RICERCA DI UN MEZZO ECO-COMPATIBILE DI LOTTA AL BRUSONE a basso impatto ambientale per la sostenibilità della produzione del riso Ricerca geni chiave coinvolti nella risposta di difesa del riso per la selezione di varietà di riso più resistenti Valutazione di sostanze naturali ad attività antifungina nei confronti di Pyricularia Identificazione di prodotti biostimolanti e/o microorganismi di biocontrollo LOTTA INTEGRATA AL BRUSONE DEL RISO Secondo le direttive della nuova PAC e delle “European Integrated Farming Framework Guidelines (2011) la gestione della coltura deve essere realizzata integrando tutti i sistemi/strumenti disponibili STRATEGIA DI GESTIONE INTEGRATA a 360° VANTAGGI sostenibilità della produzione del riso nel rispetto dell’ambiente mantenimento della biodiversità della risaia vantaggio economico per l’agricoltore competitività sul mercato sicurezza alimentare per i consumatori LOTTA INTEGRATA AL BRUSONE DEL RISO RICERCA GENI CHIAVE COINVOLTI NELLA RISPOSTA DI DIFESA DEL BRUSONE VERIFICA EFFICACIA SAPONINE VALUTAZIONE EFFETTI DI UN BIOSTIMOLANTE APPLICAZIONE SISTEMI SU GENOTIPI PIU’ ADATTI ALLA GESTIONE INTEGRATA PER LA LORO EFFICIENZA D’USO DELLE RISORSE VERIFICA APPLICAZIONE COMBINATA IN CAMPO STRATEGIA DI GESTIONE INTEGRATA GENI CHIAVE NELLA DIFESA DEL BRUSONE La comprensione dei meccanismi molecolari e metabolici attivati nel riso in risposta a brusone permetterà di identificare geni utili per lo sviluppo di varietà resistenti. Inoltre sarà possibile selezionare i target di nuove molecole o composti capaci di attivare il sistema di difesa innato del riso Lo studio ha previsto : Analisi di trascrittomica globale di piante di riso post-infezione con 4 ceppi di P. grisea caratterizzati da diversi comportamenti e incidenza della virulenza verso un genotipo di riso di riferimento: FR13 = capace di infettare varietà in esame BR32/CL367 = non infettano riso per reazione gene x gene BR29 = non infetta varietà in esame Analisi dei geni che sono differenzialmente espressi durante le 4 interazioni a 12 / 24 ore post- infezione Identificazione dei geni espressi unicamente durante l’infezione di FR13/BR29 e dei geni comuni alle 4 interazioni Analisi dei pathway metabolici per identificare similitudini e differenze tra le 4 interazioni GENI CHIAVE NELLA DIFESA DEL BRUSONE 12 ore post-infezione massiva risposta del alle 4 interazioni: una frazione consistente dei geni indotti sono comuni alle 4 interazioni è visibile una differenza a livello dei geni repressi tra i 3 ceppi di BR32, CL367, FR13 e Pyricularia BR29 24 ore post-infezione differenziazione drastica: il numero di geni di riso indotti si riduce nettamente in BR32/CL367 aumenta enormemente la repressione genica post-infezione con FR13 percentuali molto basse di geni indotti comuni e nulle per quelli repressi cinetica di espressione è una strategia di difesa messa in atto dal riso in risposta all’attacco del patogeno e in funzione della virulenza del ceppo GENI CHIAVE NELLA DIFESA DEL BRUSONE ANALISI ECOTILLING Targeted Enrichment Sequencing (SureSelect, Agilent) INSIEME DI QUESTI Parallelamente è in DATI HA FORNITO corso l’analisi della UNA variabilità di LISTA DI CANDIDATI sequenza di alcuni di DA CARATTERIZZARE questi geni candidati A LIVELLO in un gruppo di 96 FUNZIONALE UTILI PER LO SVILUPPO DI VARIETA’ RESISTENTI genotipi di riso italiano per l’identificazione di marcatori molecolari SAPONINE soyasapogenol B OH - metaboliti secondari delle piante, soprattutto leguminose HO HO OH HO - prodotte per la difesa da stress biotici e abiotici - nota attività antimicrobica, antimicotica, insetticida, - presenti nella pianta in concentrazione variabile glucuronic acid HOOC OH O O O O HO O galactose HO H3C HO O rhamnose Medicago sativa HO Lo studio ha implicato: Caratterizzazione genotipica e catalogazione di ceppi P.grisea isolati durante il progetto Valutazione in vitro dell’attività antifungina e/o fungistatica di saponine isolate da Medicago verso ceppi di P.grisea isolati durante il progetto Analisi dell’efficacia di queste molecole contro ceppi di P.grisea in planta su genotipo altamente suscettibile in condizioni controllate in confronto a fungicida Valutazioni delle saponine su genotipi mediamente suscettibile e resistente in condizioni controllate VERIFICA EFFICACIA SAPONINE Caratterizzazione genetica dei ceppi P.grisea L’analisi tramite Neighbor Joining delle distanze genetiche ottenute dai profili SSR ha indicato l’esistenza di 5 gruppi principali (A, B, C, D, E). Isolati in esame condividono similarità genetica con i lineages E1-E2 (gruppo E), E4-E5 (gruppo C). HN01 del lineage ungherese E3 diverge dai gruppi principali, così come in Roumen et al. (1997). I gruppi A, B e D non includono nessun ceppo di riferimento, suggerendo l’esistenza di cluster che potrebbero rappresentare nuovi aplotipi caratteristici dell’areale lombardo In base ai risultati di diversità genetica sono stati scelti gli isolati rappresentativi dei gruppi principali per le prove di efficacia delle saponine. VERIFICA EFFICACIA SAPONINE FENOTIPIZZAZIONE BLASTEST per effettuare una stima quantitativa degli effetti di un trattamento Dopo 7 giorni dall’infezione si osservano i sintomi fogliari secondo una scala di incidenza/severità della malattia che va da 1 (assenza della malattia) a 5 (grave incidenza). Dalle categorie di incidenza della malattia si estrapolata l’efficacia del trattamento delle saponine 3 principali classi/livelli di protezione P- pianta protetta - sintomi 1 e 2: assenza/lieve malattia NP- pianta non protetta - sintomi 4 e 5 elevata/grave malattia MP- pianta mediamente protetta – sintomi 3:media incidenza VERIFICA EFFICACIA SAPONINE - MARATELLI Applicazione delle saponine sia in pre - (24 ore prima) sia in post - infezione (3 gg dopo infezione) sciolte alla concentrazione di 10 g L-1 in soluzione di acqua e gelatina (0,5%) FUNGICIDA: formulato di flutriafol nella concentrazione normalmente utilizzata in campo (250 mg L-1) Due trattamenti (fungicida e saponine) risultano altamente significativi (p-value <0,001) rispetto al controllo (pianta non trattata) Il trattamento con le saponine risulta significativamente più efficace (p-value<0,001) applicato in pre-infezione piuttosto che in post-infezione Fungicida non mostra differenze significative tra pre- e post-infezione VERIFICA EFFICACIA SAPONINE - BALDO E SELENIO BALDO e SELENIO avevano mostrato elevata efficienza d’uso della risorsa idrica e dell’azoto nelle altre prove del progetto BIOGESTECA Applicazione delle saponine sia in pre - (24 ore prima) sia in post - infezione (3 gg dopo infezione) sciolte alla concentrazione di 10 g L-1 in soluzione di acqua e gelatina (0,5%) Baldo la riduzione delle categorie 4/5 è maggiore di quella osservata con Maratelli e drastica con Selenio Foglie senza sintomi o con sintomi limitati prevalgono in Baldo e sono dominanti in Selenio Confermato che il trattamento è più efficace in condizioni di pre-infezione, con un maggior aumento della classe P rispetto a quanto osservato in post-infezione sia in Baldo che in Selenio VERDEVIVA Verdeviva è una soluzione elettrochimicamente attivata ottenuta da KCl ed acqua utilizzando il sistema EVA System® 100 di Industrie De Nora S.p.A. Lo studio ha implicato: In precedenti prove sperimentali, il Verdeviva ha dimostrato azione battericida/fungicida e capacità di stimolare le difese endogene di piante orticole: rappresenta, quindi, una promettente alternativa o strumento integrativo anche per il controllo di Pyricularia Analisi dell’efficacia di queste molecole contro ceppi di P.grisea in planta su genotipo altamente suscettibile in condizioni controllate in confronto a fungicida Valutazioni delle saponine su genotipi mediamente suscettibile e resistente Valutazione effetto additivo tramite 2 applicazioni successive Applicazione del Verdeviva sia in pre - (24 ore prima) sia in post- infezione (3 gg dopo infezione) alla concentrazione di 500 ppm in soluzione acquosa con bagnante VALUTAZIONE EFFETTI DI UN BIOSTIMOLANTE Leggero aumento della classe MP mediamente protetta, rispetto al controllo (pianta non trattata). Maggiore effetto se applicato in post-infezione simile a quanto osservato con l’applicazione del fungicida Efficacia del Verdeviva risulta decisamente più rilevante con Baldo e Selenio Effetto additivo delle due applicazione successive (24 e 72 ore post-infezione), in accordo con una potenziale azione biostimolante del Verdeviva, è confermato e più marcato nel Baldo Lievi variazioni degli effetti in funzione della tempistica di applicazione (24 o 72) nel Selenio. CONCLUSIONI Le ricerche sui geni chiave coinvolti nella risposta del riso a Pyricularia hanno identificato i geni chiave coinvolti nelle risposte innate della pianta di interesse per lo sviluppo di nuove varietà più resistenti al brusone L’utilizzo di miscele di saponine è una soluzione promettente per la difesa biologica nei confronti dell’agente del brusone del riso L’utilizzo di saponine è auspicabile anche in un’ottica di eco-sostenibilità globale, perché la loro efficacia è maggiore quando applicate a genotipi a maggiore efficienza d’uso delle risorse La soluzione Verdeviva si è dimostrata uno strumento alternativo e integrativo da utilizzare nel controllo del brusone e nell’innalzamento delle difese innate del riso L’uso della soluzione Verdeviva sarebbe integrabile all’uso delle saponine o altri fungicidi naturali in un’ottica di difesa integrata I sistemi di protezione testati nell’ambito del progetto BIOGETSECA sarebbero utilizzabili in sinergia in un’ottica di completa strategia di difesa e gestione integrata del riso FONDO PER LA PROMOZIONE DI ACCORDI ISTITUZIONALI “Piattaforma di biotecnologie verdi e di tecniche gestionali per un sistema agricolo ad elevata sostenibilità ambientale” Ricerche a cura di Laura Crispino , Barbara Menin, Pamela Abbruscato Genomica Riso, Fondazione Parco Tecnologico Padano (PTP) Elisa Biazzi, Maria Carelli, Patrizia Gaudenzi, Carla Scotti, Aldo Tava CRA – Centro di Ricerca per le Produzioni Foraggere e Lattiero Casearie (CRA-FLC) PER MAGGIORI DETTAGLI Pamela Abbruscato Via Einstein, Loc. Codazza, 26900 Lodi Tel. 0371.4662623 email: [email protected] http://www.tecnoparco.org/ricegenomics Aldo Tava Viale Piacenza 29, 26900 Lodi Tel. 0371.403740 email: [email protected] http://centroflc.entecra.it