dalle cellule staminali ai neuroni

Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
Capitolo 2:
Dalle cellule staminali neurali ai
neuroni
2.1 Le cellule staminali
Negli ultimi anni il cervello umano e dei roditori ha dimostrato di possedere cellule
precursori indifferenziate, mitoticamente attive e multipotenti, in grado di rigenerare neuroni e
cellule gliali ( queste provvedono alla protezione ed al sostentamento dei neuroni. Sono
costituite dagli astrociti, dagli oligodendrociti e dalle cellule ependimali). Mentre molti
esperimenti hanno individuato le presenza di CELLULE STAMINALI (SC) nel cervello
adulto in vivo, testato la proliferazione, la capacità di rigenerarsi e di self-renewal, molti altri
hanno portato avanti metodologie che fanno si che queste stesse SC possano espandersi e
maturare in vitro.
Le SC sono elementi indifferenziati che fungono da riserva per i precursori indifferenziati dei
tessuti. Giocano un ruolo omeostatico essenziale rimpiazzando cellule di tessuto differenziato
morte o distrutte a causa di traumi o malattie. [Galli03]
Per riconoscere le SC devono essere verificate le seguenti condizioni:
una cellula è una SC se:





È una cellula indifferenziata che non ha marker di cellule tessutali differenziate.
È capace di proliferare.
Ha capacità di self-renewal.
È capace di generare una progenie funzionale e differenziata.
È capace di rigenerare tessuti dopo un trauma.
Grado di differenziamento
Il primo carattere distintivo delle cellule staminali, comune a tutti i tipi di staminali, è il loro
stato altamente indifferenziato. Questo significa che non possiedono le caratteristiche
morfologiche, strutturali, molecolari o antigeniche che si ritrovano nelle cellule differenziate
del tessuto cui appartengono. Per esempio, i tipi cellulari maturi che costituiscono il tessuto
nervoso sono gli astrociti, gli oligodendrociti e i neuroni. In generale i primi rappresentano le
cellule di supporto strutturale, biochimico e funzionale per i neuroni, i cui processi cellulari
che conducono gli impulsi nervosi di tipo elettrico sono invece avvolti e isolati da membrane
prodotte dagli oligodendrociti. Questo implica che ognuna di queste cellule possieda una ben
precisa organizzazione morfologica e strutturale, che si riflette nell'espressione di proteine
specifiche, utilizzate come marcatori, che quindi le caratterizzano. Ciò non si riscontra nelle
cellule staminali del CNS che sono indifferenziate, hanno spesso morfologia amorfa e l’unico
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marcatore che esprimono é GFAP (glial fibrillar acidic protein), proteina caratterizzante gli
astrociti ed è per questo che talvolta vengono dette “Astrocyte-like cells” [Alvarez-Buylla02]
Capacità proliferativa
La proliferazione è quel processo che ha come risultato finale la divisione della cellula. Il
processo avviene attraverso l’espressione ordinata e ciclica di pattern di geni caratteristici, i
cui prodotti possono variare in modo graduale o brusco. Se vengono generate due cellule con
lo stesso fenotipo (entrambe uguali alla cellula di origine o entrambe progenitori), la divisione
é detta “simmetrica”. Se invece si ottengono due cellule con fenotipo diverso (una staminale e
un progenitore) si parla di divisione “asimmetrica”.
Capacità di automantenimento
L'automantenimento sottintende la capacità di una singola cellula, o di una popolazione
cellulare, di perpetuare se stessa; in molti casi il periodo di automantenimento si estende per
tutta la vita dell’organismo, ed in vitro può permanere in maniera illimitata nelle opportune
condizioni sperimentali.
Negli invertebrati è attivo un meccanismo di tipo deterministico: secondo questo modello
ciascuna cellula staminale è dotata della capacità di automantenimento e perpetua se stessa
attraverso divisioni esclusivamente asimmetriche. É da notare che in questo modo si ha un
continuo aumento degli elementi differenziati, mentre il numero di cellule staminali presenti
resta invariato, a prescindere dal numero di divisioni compiute dalla cellula staminale. Il
sistema consente l’automantenimento del compartimento staminale solo nel caso in cui non
siano presenti fenomeni di apoptosi o necrosi delle cellule staminali di partenza.
Nei vertebrati il numero di cellule staminali all'interno di un determinato compartimento è
regolato a livello di popolazione cellulare e l'automantenimento implica la capacità di una
popolazione staminale di mantenere inalterato il numero delle cellule che la compongono.
Questo avviene poiché le cellule staminali sono in grado di effettuare divisioni simmetriche in
cui le due cellule figlie che sono generate sono identiche tra loro e alla cellula madre
(divisione simmetrica espansiva) o, in alternativa, identiche tra loro ma diverse dalla cellula
madre staminale - sono cioè cellule più differenziate, dette progenitori (divisione simmetrica
differenziativa). L'automantenimento è ottenuto grazie allo stabilirsi di un perfetto equilibrio
numerico tra i due tipi di divisione simmetrica. Se questo sistema permette che il numero di
cellule staminali si mantenga costante alla fine di ogni generazione cellulare, esso offre inoltre
l'enorme vantaggio di potere aumentare o diminuire il numero di cellule staminali all'interno
di un tessuto. Infatti, se a seguito di una lesione alcune cellule staminali muoiono, molecole
diffusibili liberate dalle cellule stesse o alterazioni nella comunicazione intercellulare possono
indurre un cambiamento nel bilancio tra divisioni espansive e differenziative all’interno della
popolazione staminale, favorendo le prime e producendo un temporaneo aumento nel numero
di cellule staminali prodotte. Nel caso in cui il numero di cellule staminali tenda invece ad
aumentare in modo abnorme per eventi casuali o patologici, l'equilibrio tra divisioni
proliferative e differenziative si sposta in favore delle seconde ed il numero di staminali tende
a diminuire, normalizzandosi. In entrambe le situazioni, non appena i segnali di emergenza si
esauriscono, la popolazione staminale ritorna all'equilibrio stazionario tipico di situazioni
fisiologiche.
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Capitolo 2
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Capacità di rigenerare un tessuto a seguito di danno (omeostasi)
La capacità delle cellule staminali di mantenere la funzionalità dei tessuti nell’organismo
adulto è la diretta conseguenza della loro capacità proliferativa e della multipotenzialità.
Per mantenere l’omeostasi del tessuto l’organismo utilizza una strategia che prevede
l’esistenza di una popolazione di cellule posta a metà strada fra le cellule staminali e le cellule
terminalmente differenziate dal punto di vista della capacità proliferativa e differenziativa e
che abbiamo già definito in precedenza come progenitori. La loro esistenza è dovuta al fatto
che la via che porta da una cellula staminale ad una funzionalmente competente può essere
vista come una transizione da un estremo, ovvero cellule staminali, in cui si ha capacità
proliferativa, all’estremo opposto, ovvero cellule terminalmente differenziate non più in grado
di dividersi. Poiché il passaggio avviene per stadi, fra questi due estremi si colloca una
popolazione di cellule eterogenea che possiede entrambe le potenzialità anche se in modo più
limitato: queste ad esempio possono proliferare solo per un numero limitato di cicli, poi la
loro capacità proliferativa si arresta e differenziano in modo terminale. Caratteristica
fondamentale di queste cellule è anche una certa flessibilità, cioè la possibilità di rallentare o
accelerare uno o entrambi i processi.
Però, come ben si può immaginare, non è possibile testare tutte le SC “candidate” per ognuna
di queste opzioni. Di conseguenza alcune di queste hanno assunto un peso maggiore per il
riconoscimento di SC:
 Self-renewal
 Capacità di generare una progenie differenziata
 Abilità di rigenerare un tessuto
Per sottolineare inoltre la differenza tra SC e cellule progenitrici, che possono essere
trovate anch’esse nel cervello, la definizione di SC del Sistema Nervoso Centrale (CNS) è
così applicata ai precursori neurali che hanno mostrato self-renewal in maniera estesa e
possono essere propagate per mesi, dimostrando la capacità di generare neuroni, astrociti (
particolarmente numerosi nella sostanza grigia sono piccole cellule stellate con numerose
propaggini che prendono rapporto con i vasi sanguigni e con i neuroni. Queste propaggini
circondano le sinapsi, cioè le aree di contatto fra i neuroni che permettono la trasmissione
degli impulsi nervosi da una cellula all’altra) e oligodentrociti (provvedono infatti a costruire
la mielina, il rivestimento isolante che avvolge i nervi). Questa caratteristica è definita
MULTIPOTENZA.
Multipotenzialità
Caratteristica fondamentale delle cellule staminali è la multipotenzialità, in altre parole la
capacità di dare luogo a una progenie differenziata comprendente tutti i tipi cellulari del
tessuto di residenza o, nel caso delle embrionali, a tutte le cellule dell’organismo adulto. La
formazione di cellule differenziate a partire da cellule staminali avviene dando origine a
cellule intermedie che costituiscono il cosiddetto compartimento dei progenitori di transito,
cellule più differenziate rispetto alle staminali ma che mantengono la capacità di proliferare
per un numero limitato e predeterminato di cicli mitotici, generando alla fine un elevato
numero di cellule differenziate. Così da una singola divisione di una cellula staminale, grazie
al compartimento di transito, vengono generate numerosissime cellule differenziate. Tale
meccanismo consente la produzione di un consistente numero di cellule mature a fronte di un
numero di divisioni delle cellule staminali ridotto. In questo modo, il patrimonio genetico
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delle cellule staminali risulta protetto dal rischio di mutazioni che potrebbero accumularsi
durante la replicazione del DNA che ha luogo ad ogni divisione cellulare. L'esistenza di
compartimenti cellulari multipli e gerarchicamente definiti, inoltre, permette di regolare la
produzione di cellule mature, sia variando la velocità di proliferazione e la modalità di
divisione all'interno del compartimento staminale, sia modulando la lunghezza di ciclo e il
numero totale di divisioni nella popolazione di transito. Si crea così un sistema di regolazione
altamente integrato e flessibile, che consente di rispondere agli stimoli regolatori presenti nel
tessuto ed è in grado di soddisfare le esigenze di ricambio cellulare che si presentano in un
organo o tessuto nell'arco della vita adulta.
Secondo questo modello, i tessuti che si rinnovano utilizzando le staminali sarebbero
organizzati a compartimenti cellulari multipli e gerarchicamente definiti. In particolare
possono essere individuate tre popolazioni: da un lato le cellule staminali (S), all’altro
estremo le cellule mature (M) e in mezzo i progenitori di transito (T).
I vantaggi legati ad una tale organizzazione del tessuto, rispetto ad uno schema che prevede
solo due compartimenti, sono diversi:
- La popolazione T funziona da “cassa di risonanza” per le staminali, poiché consente la
produzione di un consistente numero di cellule tissutali mature a fronte di un numero di
divisioni ridotto nel pool cellulare di partenza. Questo riduce notevolmente la possibilità di
creare mutazioni nel materiale genetico delle staminali, rischio che si propone di nuovo ad
ogni replicazione del DNA
- Il sistema consente una regolazione più fine dell’omeostasi tissutale: immaginando un
controllo a feed-back esercitato dalla popolazione M attraverso fattori solubili, si ha una
doppia possibilità di modulazione della produzione di cellule mature con risultati
quantitativamente diversi nel caso in cui il controllo sia esercitato con un loop breve (dal
compartimento M al compartimento T) o con un loop lungo (dal compartimento M al
compartimento S). Nel primo caso varieranno la lunghezza del ciclo e il numero di divisioni
dei progenitori di transito e verranno prodotti elementi maturi in modo rapido ma
quantitativamente limitato, nel secondo caso si ha la possibilità di agire sulla velocità di
proliferazione e sulla modalità di divisione del compartimento staminale determinando un
aumento ingente del numero di progenitori prima e di quello di cellule mature poi
(naturalmente per vedere gli effetti del secondo stimolo é necessario un periodo di tempo più
lungo).
Quindi il termine “cellule progenitrici” è usato per indicare cellule indifferenziate che però
posseggono una capacità proliferativa e un potenziale evolutivo più ristretto.
Si usa poi definire altri due tipi di SC:
 TOTIPOTENTI: embrioni alla stadio di 4-8 cellule dopo 4-5 giorni dalla
fecondazione, le cellule non sono specializzate e hanno la potenzialità di differenziarsi
in tutte le linee cellulari necessarie a formare l’embrione. Quindi sono capaci sia di
formare diverse linee cellulari, sia di originare un nuovo embrione
 PLURIPOTENTI: embrione allo stato di blastocisti con 20-30 cellule, dopo 5-7 giorni
dalla fecondazione, hanno la potenzialità di differenziarsi in ogni tipo di cellula ma
non hanno la potenzialità di dare origine ad un embrione.
Le SC possono essere isolate da diversi tipi di tessuti:
 FETALE: cellule staminali derivanti da aborti spontanei, possiedono caratteristiche
intermedie fra quelle embrionali e quelle adulte.
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 EMBRIONALI ETEROLOGHE: cellule staminali derivate dalla regione interna
dell’embrione prima del suo impianto nella regione interna dell’utero. Sono dotate di
una elevata capacità proliferativa e possono dare origine a tutti i tipi cellulari presenti
nell’organismo umano. Possono essere isolate da blastocisti e cresciute in vitro. Una
volta cresciute, per esempio in un embrione, possono differenziarsi in diversi tipi
cellulari senza causare problemi di crescita all’embrione. Sono state studiate cellule
staminali sia in embrioni congelati che donati.
 DA CORDONE OMBELICALE: sono ricavate dal sangue del cordone ombelicale e
possono essere utilizzate dopo decenni per la cura di patologie di cui il paziente
potrebbe essere affetto durante la vita. Attualmente vengono impegnate per il
trattamento di patologie ematologiche.

 ADULTE: riparano i tessuti danneggiati ma la loro capacità riproduttiva è limitata.
Problema: la loro possibile espansione in vitro è limitata per ora ai roditori;
TESSUTI DA CUI E’ POSSIBILE ISOLARE CELLULE STAMINALI:
Midollo osseo; sangue; sistema nervoso; muscolo; sangue del cordone ombelicale; embrioni
alle prime fasi di sviluppo; tessuti del feto (cellule germinali); tessuti del fegato; cuore.
2.2 Le cellule staminali neurali
Caratterizzazione delle cellule staminali nervose adulte
Fino a pochi anni fa si riteneva che il tessuto nervoso fosse un cosiddetto tessuto perenne; in
questo tipo di tessuti le cellule si moltiplicano soltanto durante il periodo embrionale e una
volta iniziato il differenziamento non hanno più la possibilità di aumentare il loro numero,
quindi la lunghezza della loro vita molto spesso coincide o é inferiore a quella dell’individuo.
Solo negli anni ‘90 [Reynolds92] è venuta alla luce una scoperta che ha cambiato
completamente il modo di vedere il sistema nervoso. Sono infatti state trovate cellule ad uno
stato ancora indifferenziato nel cervello di roditori adulti, nella zona sottoventricolare (SVZ)
del ventricolo laterale che, in vivo, migrano attraverso l’estensione rostrale verso il bulbo
olfattorio [Gritti02] e durante questo percorso possono subire un processo di
differenziamento. Studi più approfonditi hanno dimostrato inoltre che l’SVZ è composto da
più compartimenti. Di questi, quello anteriore, denominato SVZa, è specializzato in precursori
neurali destinati al bulbo olfattorio, mentre quello posteriore produce cellule proliferanti che
possono morire o dare origine a glia [Doetsch97].
In un primo tempo, si ritenne che la presenza di neurogenesi indicasse l’esistenza nei tessuti
di precursori neuronali, vale a dire cellule ad uno stadio di differenziazione inferiore rispetto
ai neuroni maturi. Solo in tempi più recenti, è stata ipotizzata la presenza di cellule staminali
neurali, in analogia con tessuti definiti rinnovabili, come il sangue e l’epitelio intestinale. A
causa dell’assenza di specifici markers molecolari o antigenici in grado di permettere il
riconoscimento delle cellule staminali da quelle progenitrici, attualmente ci si basa
principalmente su esperimenti condotti su colture in vitro per verificare la natura staminale
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delle cellule presenti in una determinata regione cerebrale ovvero ne viene data una
definizione funzionale.
Nel 1992 Reynolds e Weiss [Reynolds92] isolarono per la prima volta cellule staminali
dallo striato di topi adulti, utilizzando un terreno di coltura contenente il fattore di crescita
epidermico (EGF) e un substrato non adesivo. In queste condizioni una parte delle cellule
ottenute dalla dissociazione del tessuto cerebrale cominciò a proliferare, così che dopo 6-8
giorni nelle colture erano riconoscibili clusters di cellule indifferenziate (negative per i
markers antigenici delle cellule nervose mature). Ad analisi successive, questi cloni
dimostrarono di possedere i requisiti fondamentali delle cellule staminali ovvero la capacità di
proliferare in modo espansivo generando progenie identica alla madre (automantenimento) e
di dare origine a neuroni, oligodendrociti e astrociti (multipotenzialità). Solo successivamente
fu dimostrato che tali cellule risiedono in realtà nello strato subependimale dei ventricoli
laterali (SVZ) e non nello striato e che possono essere isolate anche utilizzando il fattore di
crescita dei fibroblasti (FGF2) [Gritti96] o una combinazione di EGF e FGF2 [Gritti99].
Per valutare la natura staminale delle cellule che risiedono nell’SVZ, queste furono cresciute
in vitro in terreni privi di siero, addizionati dei fattori di crescita EGF o FGF2. L’EGF,
indusse una popolazione di cellule a proliferare in modo estensivo, formando cluster di cellule
che furono denominati neurosfere, all’interno delle quali erano presenti anche le staminali. Lo
stesso avvenne quando le cellule dell’SVZ furono poste alla presenza del solo bFGF.
Esperimenti recenti, hanno dimostrato che le cellule staminali responsive all’EGF e all’FGF2,
derivano da un unico precursore che risponde ad entrambi i fattori di crescita, confermando
l’ipotesi che la proliferazione di ogni singolo precursore presente nell’SVZ é sotto il controllo
di più fattori di crescita .
Le cellule staminali appena descritte sono state isolate nel cervello di roditori adulti. É stato
possibile isolare [Vescovi99] cellule staminali neurali anche dal diencefalo umano di feti
abortivi di 10.5 settimane. Le condizioni di crescita delle cellule staminali umane isolate da
diencefalo erano le medesime utilizzate per le cellule staminali murine con l’unica differenza
della necessità della presenza simultanea dei fattori trofici (EGF, FGF2) per ottenere la
crescita delle colture cellulari. Anche per le cellule staminali neurali umane è stata eseguita
l’analisi clonale che dimostra la capacità di automantenimento e la multipotenzialità di queste
cellule a dare neuroni, oligodendrociti ed astrociti. La scoperta di cellule staminali neurali
umane capaci di rinnovarsi dando origine ai tre tipi cellulari presenti nel cervello apre quindi
le porte a nuove terapie per la cura delle malattie neurodegenerative.
Isolamento ed espansione
Come già detto, le cellule staminali neuronali (NSC) vengono isolate da diverse parti del
SNC di mammiferi adulti [Bottai03]. Le due zone più ricche sono la SUB VENTRICULAR
ZONE (svz) e l’IPPOCAMPO.
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figura 1(A): ippocampo adulto; (B) svz evidenziata in grigio.
figura 2: localizzazione delle staminali
Una volta isolate queste possono proliferare in vitro, utilizzando FGF2 e EGF. Come
mostrato in figura 4, una NSC può dividersi a formare altre due NSC, oppure può dividersi a
formare du cellule progenitrici, o due cellule differenziate, o due NSC con destino
progenitore. La proliferazione avviene in maniera particolare in quanto dopo 7-8 in coltura, da
una singola NSC si ottiene una cosidetta NEUROSFERA formata da tutte e tre le forme
cellulari (NSC 10-50%).
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figura 3: neurosfere
Più precisamente alll’interno della sfera troviamo cellule differenziate, mentre nelle parti
esterne troviamo via via cellule indifferenziate per arrivare allo strato più esterno che è
composto da NSC.
A questo punto è possibile dissociare meccanicamente le sfere e rimettere in coltura le
singole cellule ma operando una selezione. Infatti usando come medium di coltura FGF2 e
EGF, le cellule non-NSC moriranno a breve mentre le NSC continueranno a proliferare.
Questi passaggi possono essere effettuati più volte e avendo la possibilità di poter congelare le
NCS e possibile in breve tempo creare un stock di NSC. Il processo di congelamento è
alquanto semplice in quanto basta porre le NSC in DMSO 10% A -80° C prima e in azoto
liquido poi.
Una volta congelate la NSC hanno la straordinaria caratteristica di poter essee scongelate
senza particolari problemi conservando tutte le loro qualità.
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STEM
PROGENITOR
DIFFERENTIATED
figura 4: la proliferazione delle NSC
Per quanto riguarda i “marker” per le NSC, è importante ricordare la NESTINA (marker
cellulare di filamento intermedio neuroectodermale) che è considerato necessario, anche se
non sufficiente, a definire una NSC. Inoltre troviamo l’espressione di EGFR (recettore per
l’EGF). Se si ha l’espressione di Dlx2, invece è noto che le NSC hanno cominciato il loro
processo di differenziamento. Una volta completato il differenziamento (neuroni,
oligodentrociti e astrociti) in coltura mediante la stimolazione tramite NGF e la successiva
loro rimozione (vedi dopo), è possibile marcare le cellule mediante Tuj1 che identifica i
neuroni, GFAP che identifica gli astrociti e O4 o GAL C per identificare gli oligodentrociti.
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figura 5: (B) singole NSC; (C) primo piccolo cluster di NSC; (D) neurosfere; (E) immunostaining con Tuj1 (rosso), galc
(blu), GFAP (verde), DAPI (blu)
Coltura di cellule staminali neurali umane e murine adulte
Le cellule umane usate per l’esperimento da me condotto sono state isolate da diencefalo di
feti UMANI abortiti spontaneamente a 10,5 settimane di gestazione (evitando così ogni
possibile problema etico). [Gritti01], mentre le cellule murine sono state isolate dalla zona
sottoventricolare di topi adulti CD1. Le cellule staminali si prestano molto bene a questi tipi
di esperimenti su MEAs in quanto, come appena deto è possibile ottenere un gran numero di
cellule staminali umane/murine da una sola singola cellula staminale umana/murina.
L’isolamento può avvenire sia in presenza che in assenza di siero. In questo protocollo
descriverò l’isolamento in assenza di siero (free-serum) e in condizioni chimiche
completamente definite. Utilizzando questa tecnica, la coltura di NCS rappresenta un sistema
selettivo nel quale molte cellule primarie differenziate del SNC sono eliminate subito dopo
l’isolamento e la deposizione in coltura, mentre al contrario le NCS indifferenziate entrano in
uno stato attivo di proliferazione.
Quattro sono le condizioni che devono essere soddisfatte affinché si sia certi che in coltura
la NCS siano le cellule più presenti:




Densità cellulare bassa (5x104 cells/cm2 )
Assenza di siero
Addizione di appropriati fattori di crescita: EG F e FGF2 (o BDNF, GNDF, CNTF)
Assenza di un substrato di adesione forte (poly-l-lysine)
Sotto queste condizioni, cellule del NSC non riescono ad attaccarsi al substrato e muoiono
in 2-3 gg. Nel frattempo però una piccola frazione di precursori indifferenziati si aggrega e
comincia a proliferare rimanendo attaccata al substrato. La progenie generata da queste cellule
rimane anch’essa attaccata al substrato e tende ad aggrupparsi a formare le neurosfere. A
questo punto a causa dell’aumento di massa, le sfere lasciano il substrato e vanno in
sospensione. È importante comunque sottolineare che non tutta la progenie delle NSC iniziali
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Capitolo 2
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che si trova aggregata nelle sfere è ancora rappresentata da NSC. Solo una frazione (10-50%)
della progenie mantiene le caratteristiche di NSC. Le cellule restanti si differenziano
spontaneamente.
Questo è il motivo per cui queste sfere vengono subiscono SUBCOLTURA, durante la quale
le cellule già differenziate o in via di, muoiono, mentre le NSC continuano a vivere e
proliferare generando sfere secondarie che subiranno una ulteriore subculturing. Questa
procedura può essere ripetuta tante volte, fino al raggiungimento del numero voluto di NSC.
Eseguendo comunque le procedure in modo corretto l’aumento delle NSC è, come è facile
intuire, esponenziale.
Una cosa importantissima da ricordare è che la densità deve essere assolutamente tenuta
bassa perché in caso contrario i diversi tipi cellulari presenti in coltura tendono ad aggregarsi
formando delle sfere simili alle neurosfere anche non essendo in presenza di proliferazione. È
facile capire che un errore del genere indurrebbe a risultati errati.
2.3 Materiali e metodi
I tessuti umani sono stati prelevati da cervelli ottenuti da feti umani abortiti naturalemente
dopo 10 giorni di gestazione. Le cellule staminali sono state prelevate dal telencefalo e dal
diencefalo. I tessuti murini sono stati prelevati da cervelli di topi CD1 adulti. Le cellule
staminali murine sono state prelevate dalla zona sottoventricolare.
I prodotti chimici sono della Sigma, BDH, Invitrogen, Qiagen, Stratagene, Promega,
Biowhittaker, Gibco, Molecular Probes, Calbiochem, Euroclone, Dako.
La plasticheria ed i consumabili sono stati ottenuti dalle ditte Corning, Eppendorf, Falcon,
Nunclon.
Le apparecchiature utilizzate sono della Zeiss (microscopi), Sigma (centrifughe), Binder
(incubatori).
Procedura di dissezione
La rimozione e la dissezione del cervello o del midollo spinale sono effettuate fuori dalla
cappa a flusso laminare. Bisogna avere particolare attenzione nell’evitare contaminazioni e
anche per questo avere tutti gli strumenti e i materiali pronti per l’uso e a portata di mano
 Pesare la papaina, cisteina e EDTA, trasferirli in una provetta sterile da 50ml.
 Porre la provetta a 4 gradi fino alla fine della procedura di dissezione.
 Pesare l’ovomucoide in una provetta sterile e porre quest’ultima a 4 gradi fino
alla fine del periodo di incubazione enzimatica
 Mettere del PBS freddo in una piastra petri sterile: 1 o 2 piastre per deporre il
tessuto, diverse petri per il lavaggio del tessuto, qualche altra per deporre il
tessuto dissezionato.
 Tutti gli strumenti per la dissezione devono essere sterilizzati e poi immersi in
etanolo 70%
 Preparare e settare la piattaforma oscillante.
 Riscaldare il medium di coltura a 37 gradi in un bagno termostatico
 Riscaldare EBSS a temperatura ambiente
 Prima di iniziare la procedura di dissezione bisogna aggiungere 30 ml di EBSS
alla provetta contenente la papaina, la cisteina e l’EDTA. Vortexare finchè la
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Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
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soluzione non diventa limpida. Aggiungere a questo punto 20 ml di EBSS e
arieggiare con O2 al 95% e CO2 al 5% per 30 minuti. Adesso è possibile
iniziare la dissezione.
Una volta estratti il cervello o il midollo spinale usando un microscopio a 25X,
trasferirli in una nuova petri contenente PBS.
Da questo momento in poi bisogna usare tecniche asettiche e tenere i tessuti
sotto cappa a flusso laminare.
Procedura per la dissociazione
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Usare bisturi per tagliare il tessuto dissesionato in piccoli pezzi.
Bloccare La reazione della papaina e aggiungere DNAasi 0,1%, vortexare e
sterilizzare filtrando. Etichettare una provetta per ogni regione del cervello
dissezionato e aggiungere 14ml di soluzione di papaina/DNAasi ad ognuna.
Trasferire nelle provette i pezzi di tessuto
Porre le provette sulla piastra oscillante. Incubare a 37 gradi per 30-60 minuti
in base al tipo di tessuto. Di solito i tessuti del midollo spinale richiedono più
tempo.
Alla fine dell’incubazione enzimatica, raccogliere i tessuti con centrifuga a
110X per 10 minuti.
Nel frattempo aggiungi il medium di coltura alla provetta contenente
ovomucoide e sterilizzare.
Stoppare centrifuga e rimuovere la maggior parte del surnatante e aggiungere
3ml della soluzione prima preparata (medium + ovomucoide). Dissociare
triturando 20-30 volte con una pipetta sterile. Lasciare la sospensione a riposo
per 3-4 minuti.
Centrifugare per raccogliere il pellet 110X per 10minuti.
Eliminare il surnatante lasciando solo 300 µl. Usando una pipetta sterile
dissociare il pellet 20-25 volte
Aggiungere 5ml di medium di coltura e centrifugare a 300X per 15 minuti.
Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in medium di coltura. Contare
le cellule vive con il metodo trypan blue
La densità: 3500 cellule vive/cm2 nel medium di coltura
Incubare a 37 gradi, CO2 5% in un incubatore umidificato
Le cellule dovrebbero proliferare e formare, quindi, le sfere che eventualmente
si solleveranno quando diventeranno grandi. Le prime sfere dovrebbero essere
pronte per la subculturing in 5-10 gg dopo il piastramento, in base ai GFs usati.
Una particolare attenzione va rivolta alla presenza di detriti che vanno
eliminati centrifugando in maniera adeguata, cioè non troppo vigorosamente,
onde evitare che i detriti possano mescolarsi alle sfere.
Il metodo Trypan blue dye exclusion assay
Per la determinazione della densità e della vitalità cellulare di sospensioni di colture di
cellule animali viene comunemente utilizzato il metodo ad esclusione con trypan blue; la
distinzione tra cellule vive e morte si basa sulla capacità da parte delle cellule vive di
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Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
trasportare attivamente questo colorante all'esterno, mentre le cellule morte, in cui i trasporti
attivi non funzionano più, lo trattengono all'interno.
Basato su analisi ottica di immagini, la tecnologia permette di determinare in maniera precisa
la vitalità delle cellule e la loro densità.
Procedura di subculturing
La procedura di subculturing è uno degli “step” critici nella coltura di NSC. Il numero di
NSC trovato in una sfera varia in base alla regione di isolamento, età del tessuto e specie. Nel
subculturing comunque, non tutte le cellule vivono e generano sfere secondarie. L’
EFFICIENZA DI SUBCOLTURING è un parametro che è bene tenere in considerazione
quando espandiamo NCS neurali in coltura.
Molti parametri possono influenzare l’efficienza:
 Sbagliare nella centrifugazione delle cellule/sfere
 Perdere cellule a causa di poca o troppa dissociazione meccanica
 Sbagliare il PH del medium
N.B. è possibile subcoltivare ogni sfera singolarmente.
Ecco il protocollo:
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Colpire la provetta per staccare le sfere dal fondo e trasferirle in una nuova
provetta. Risciacquare con medium di coltura fresco.
Centrifugare per raccogliere le cellule 110X per 10minuti.
Rimuovere il surnatante, non del tutto, triturare il pellet 150 volte.
Sciacquare il fondo e le pareti della provetta con medium fresco per evitare che
le cellule possano attaccarsi.
Aggiungere 5ml di medium e centrifugare a 15X per 15minuti
Rimuovere il surnatante delicatamente, dissociando 10-20 volte per disgregare
il pellet
Contare le cellule vive con esclusione di trypan blue e scegliere densità: 1x103
cells/cm2
Subcoltivare quando le cellule cominciano ad essere in sospensione
Il numero totale di cellule sale da 2 a 10 per ogni passaggio.
Lavare le cellule con medium fresco ogni 3-4 gg
Procedura per il differenziamento
L'individuazione del primo fattore di crescita ( GF ), denominato Nerve Growth Factor o
NGF, si deve al lavoro pionieristico di R. Levi-Montalcini, che nel 1986 ha ricevuto il premio
Nobel per la fisiologia o la medicina, alla quale si unì S. Cohen, che portò a termine la
caratterizzazione del NGF e isolò un nuovo fattore denominato Epidermal Growth Factor o
EGF. Da allora numerosi altri fattori di crescita sono stati identificati e isolati in forma pura.
Piastrando la progenie di NSC su di un buon substrato come per esempio matrigel, e
rimuovendo GFs è possibile promuovere un processo spontaneo di differenziazione che generi
neuroni e cellule gliali.
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Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
Le colture così differenziate possono sopravvivere più di 4 settimane in coltura con
l’aggiunta però necessaria di siero 2%. Il differenziamento in coltura avviene seguendo a
grandi linee il profilo temporale del differenziamento in vivo.
I fattori di crescita usati per le cellule staminali sui MEAs, oggetto di questo lavoro di tesi
sono stati il, GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor), BDNF (brain-derived
nurotrophic factor), CTNF (ciliary neurotrophic factor), FGF2 (basic fibroblast growth
factor):
-- GDNF perchè previene l’apoptosi neuronale e migliora la crescita di assoni e dentriti.
-- BDNF è coinvolto nelle sinapsi. È fondamentale per la sopravvivenza e il differenziamento
neuronale in vitro.
-- CTNF aumenta la proliferazione, aumenta l’attività metabolica e riduce lo stress da
differenziamento.
-- FGF2 è fondamentale per la neurogenesi e viene rilasciato dalle neurosfere.
Alternativamente possono essere usati l’FGF2, il BDNF e il LIF (leukemia inhibitory factor).
Dopo l’esposizione delle NSC i fattori di crescita (circa 10gg) la rimozione dei GFs e
l’aggiunta di un medium di controllo arricchito con FCS 2% (fetal calf serum 2%) permette la
generazione di neuroni seguiti da astroglia e oligodentrociti.
È da sottolineare il fatto che il differenziamento varia in base ai tempi in cui esso stesso è
stato fatto partire: se parte troppo tardi i neuroni muoiono. Se parte troppo presto non è
possibile individuare gli oligondentrociti.
La progenie di NSC, invece, spontaneamente si differenzia in neuroni e glia. A 7 gg dalla
piastratura, la quantità di neuroni/astroglia/oligondentrociti è rispettivamente 15/75/1.
Ecco il protocollo:
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Sterilizzare tutte le piastre e gli strumenti
Preparare il substrato senza GFs diluendolo in acqua sterile
Aggiungere 125 µl del substrato per ogni cm2 di superficie, incubare a 37 gradi
e risciacquare con PBS
Riscaldare a 37 gradi medium di controllo senza GFs e aggiungere
Incubare a 37 gradi per equilibrare
Colpire delicatamente le pareti della beuta contenente le cellule, per far
staccare le sfere
Rimuovere il contenuto della beuta e trasferirlo in una provetta sterile
Raccogliere le cellule in centrifuga 110X per 10minuti
Per eliminare per bene i GFs, sciacquare ed eliminare il surnatante e
ricentrifugare con medium
Rimuovere il surnatante lasciando 300 µl, triturare gentilmente il pellet 110150 volte
Centrifugare a 15X per 15minuti
Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 0,5ml di medium di
controllo
Contare le cellule vitali con trypan blue exclusion
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Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
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Incubare a 37 gradi
Densità cellulare : 80000-100000 cells/cm2
I neuroni possono essere osservati dopo 1-2gg, mentre individuare astroglia e
oligodentrociti può essere difficile dopo solo 48 h. allora è possibile
aggiungere FCS dopo 3-4gg. Sotto queste condizioni tutti e tre i tipi cellulari
sono visibili dopo 7 gg
Per evitare che le cellule muoiano dopo la rimozione di GFs, bisogna piastrare
su piastre con FGF2 e deve essere usata la più bassa densità possibile. In
presenza di FGF2, il differenziamento è ritardato di 1-2 gg e la presenza di
astroglia non può essere accertata del tutto finchè FCS non sia aggiunto alla
coltura dopo 3-4 gg dal pistramento. La sostituzione dell’FGF2 con un medium
di controllo, dopo l’aggiunta di FCS è consigliabile.
figura 6: Neuroni umani
Commenti: L’adesione delle cellule al substrato della piastra e la rimozione dei GFs potrebbe
determinare la perdita del 50% delle cellule è quindi consigliabile usare un gran numero di
cellule per iniziare e incrementare la densità cellulare se si nota che dopo il piastramento la
morte cellulare è elevata.
Per incrementare l’omogeneità nella popolazione cellulare è bene usare sfere che sono state
subcoltivate al minimo 2 volte (generalmente un aumento del numero dei passaggi di
subculturing non influenza le proporzioni delle cellule differenziate derivanti dalle NCS), che
non sono cresciute troppo e prelevate dopo un numero fisso di giorni dall’ultimo ciclo di
subculturing.
Se la dissociazione è stata fatta correttamente quasi la totalità delle cellule piastrate dopo la
subculturing dovrebbero essere singole.
Congelamento
Le cellule staminali neurali murine hanno una velocità di crescita molto elevata. Può essere
quindi inutile continuare ad espandere una coltura per mesi ed ottenere grossi numeri di
cellule e risulta spesso opportuno procedere al congelamento delle cellule non necessarie ai
fini sperimentali immediati ed al loro mantenimento in contenitori criogenici.
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Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
Quando le cellule hanno formato sfere delle dimensioni adeguate, vengono centrifugate a 17 g
per 15 minuti. Il surnatante viene aspirato completamente e sostituito con 1,5 ml di terreno di
coltura + DMSO (dimetilsolfossido) (Sigma) al 10% che è un crioprotettore e agisce
impedendo la formazione di cristalli d’acqua che provocano la rottura della membrana
cellulare. Le sfere vengono risospese con pipetta Gilson p1000 e trasferite in criovials. Dopo
una prima fase di congelamento lento fino alla temperatura di -80 °C, condotta in appositi
apparati che consentono una discesa della temperatura di 1 °C al minuto, le criovials vengono
poi poste in azoto liquido dove possono essere conservate per lunghi periodi di tempo.
figura 7: congelamento
Scongelamento
Le cellule congelate possono essere poste nuovamente in coltura tramite il procedimento di
scongelamento. Il campione di interesse viene prelevato dall’azoto liquido e posto in un
bagnetto termostatato a 37 °C fino a scongelamento completato. Viene poi trasferito in un
falcon contenente terreno di crescita previamente equilibrato a 37 °C per evitare ulteriori
stress termici e centrifugato a 123 g per 15 minuti. Il surnatante viene completamente
eliminato, viene aggiunto 1 ml di terreno di coltura ed il pellet viene risospeso tramite una
pipetta Gilson p1000 e piastrato in flask di dimensioni appropriate aggiungendo altro terreno
di coltura. La flask viene poi posta in un incubatore a controllo di pCO2 e temperatura e il
giorno seguente si può procedere alla dissociazione delle sfere.
Myc test
Talvolta le colture cellulari possono essere contaminate da micoplasma, un microrganismo
che provoca inizialmente una riduzione della crescita delle colture, che risultano adese, poco
trofiche e ricche di detriti derivanti da cellule morte. É pertanto necessario effettuare dei
controlli periodici tramite il Myc test che, utilizzando la PCR che permette di individuare
l’eventuale DNA di micoplasma amplificandolo e rendendolo visibile tramite elettroforesi su
gel di agarosio.
La sequenza dei primers utilizzati per questa PCR sono:
Forward primer
actcctacgggaggcagcagta
Reverse Primer
tgcaccatctgtcactctgttaacct
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Capitolo 2
Dalle cellule staminali neurali ai neuroni
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