Workshop ENEA, 4 dicembre 2003
‘Molecular farming: produzione di cibi funzionali, di nutraceutici e
biofarmaceutici’
Vaccini di origine
vegetale contro i tumori
associati al virus del
papilloma umano (HPV)
Rosella Franconi
BIOTEC GEN
SOMMARIO
• Definizioni
2. Il problema: il virus del papilloma umano
• Caratteristiche
• Vaccini profilattico
• Vaccino terapeutico
3. Le piante per lo sviluppo di vaccini anti-HPV
a) le piante come biofabbriche
b) sequenze da virus vegetali per vaccini a
DNA
4. Conclusioni e sviluppi
Definizioni
ANTIGENI Æ tutte le molecole in grado
di indurre una risposta immunitaria
VACCINI A SUBUNITA’ ÆViene usata solo una
parte del patogeno capace di indurre una
risposta immunitaria.
ADIUVANTE Æsostanza in grado di aumentare
l’immunogenicità di un dato antigene
Molti allo studio ma solo pochi approvati per uso umano
(es. alcuni sali minerali: idrossido di alluminio, fosfato
di calcio). Non sono noti i meccanismi di azione
Vaccini a subunità
Principali vantaggi:
•Sicurezza (utilizzata solo una parte del patogeno)
•Possono essere prodotti in forma ricombinante
•Le proprietà dell’immunogeno possono essere
migliorate (da fusioni geniche o mutagenesi)
Svantaggi:
•Poco immunogenici (richiedono adiuvanti e dosi
multiple)
•Costosi e poco stabili
Esempi di vaccini a subunità (ricombinanti)
Vaccini basati su singole proteine o peptidi Æ
Esempio vaccino anti-epatite B.
Espressi in sistemi eterologhi come cellule di
batterio, lievito, mammifero, insetto e pianta
Vaccini a DNA (vaccini genetici) Æ Viene
inoculato direttamente il plasmide che
contiene il gene di interesse
Principi di base della vaccinazione
Quando si disegna un vaccino è necessario
considerare il tipo di risposta immune desiderata
IMMUNITA’ UMORALE (anticorpi: es. IgG, IgA)
Æ essenziale per l’eliminazione di patogeni
extracellulari
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATA (citotossica,
CTL) Æ richiesta per l’eliminazione di patogeni
intracellulari (es. virus) o cellule tumorali
Il problema: il virus del papilloma umanoHPV
55 nm
HPV e Cancro
Più di 120 tipi di cui circa 30 tipi infettano
le mucose genitali
‘basso rischio’ (HPV 6, 11): condilomi
‘alto rischio’ (HPV 16, 18, 31, 33, 45)
agenti causali di più del 99.7% del cancro
alla cervice (anche anogenitali e alcuni tumori testa-
collo)
Più del 50% dei tumori al collo dell’utero
sono dovuti a HPV16
Le proteine di HPV
Proteine virali
E6
Funzioni
oncoproteina
E7
oncoproteina (17 KDa)
E5
E2
E1
E4
oncoproteina
fattore di trascrizione/replicazione
fattore di replicazione
facilita l’’escape’ virale (?)
L1
proteina capsidica (55 KDa)
L2
proteina capsidica
Integrazione virale nelle cellule
cancerose
Integrazione virale nelle cellule
cancerose
Prevenzione e diagnosi del cancro
al collo dell’utero
PAP test (metodo di screening, 20% falsi negativi)
Metodi molecolari per identificare il virus (S-blot,
ibridazione in situ PCR etc.)
In un futuro prossimo:
Anticorpi per individuare le oncoproteine virali
(E5, E6, E7) espresse nelle fasi cancerose
Vaccino profilattico
Vaccino profilattico anti-HPV
2002: anno del vaccino profilattico anti-HPV.
Basato sulla proteina L1 prodotta in
lievito che si auto-assembla in ‘Virus
Like Particles’ (VLPs)
VLPs
Induce anticorpi neutralizzanti contro il
virus in grado di prevenire l’infezione.
Sicuro e ben tollerato. Disponibile commercialmente tra
3-4 anni
Tuttavia
gli alti costi di produzione e distribuzione non
permetteranno una applicazione diffusa di questo vaccino
Terapia del tumore del collo
dell’utero
Chirurgia, radio-terapia, chemio-radio-terapia
Circa il 35% delle pazienti sviluppa
malattia persistente o metastasi, per le
quali non esiste adeguata terapia
In futuro: vaccini terapeutici
Vaccino Terapeutico
Deve stimolare una risposta immunitaria di tipo
citotossica (CTL) contro proteine non-strutturali
in modo di promuovere la regressione del
tumore.
Candidati: proteine E6 e E7 (Antigeni specifici
del Tumore). Poco immunogeniche.
Molti ‘trial’ clinici in corso basati su E7, come
DNA o come proteina
Espressione di proteine eterologhe in pianta
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSGENICA
(nucleare-il gene eterologo è trasmesso alla progenie. Es.
trasformazione mediata da Agrobatterio)
> SISTEMI DI ESPRESSIONE TRANSIENTE
BASATI SU VIRUS VEGETALI (il gene eterologo non
è ereditato dalla progenie. Es. infezione con virus X della
patata, PVX)
Attività 1:
Vaccino profilattico basato sulla proteina
L1 espressa in modo stabile
Risultati: molte linee transgeniche
di pomodoro che esprimono il gene
L1
L’eventuale assemblaggio di L1 in
VLPs verrà valutato (anche mediante
TEM)
??????
Attività 2:
Vaccino terapeutico basato sulla proteina E7
espressa in modo transiente tramite PVX
1
2 3
4
5
6
7
8
9
10
125.6
89.4
64.9
52.8
39.8
27.7
21.8
16.2
E7
RISULTATI:
a) L’ oncoproteina E7 è
espressa in piante di N.
benthamiana
IgG2a
IgG2b
IgG3
0
VX
wt
IgG1
5
Hi
s
Hi
s
IgGtot
10
A
0
15
-E
7+
Nb
-P
0,5
20
-E
7+
Q
ui
l
1
25
XE
7
+
1,5
30
no
ne
OD450nm
His-E7+Quil A
35
Nb
-P
V
Nb-PVXE7
2
Without E7 peptide
40
Xw
t
Nb-PVXwt
With E7 peptide (aa. 49-57)
45
Nb
-P
V
2,5
IFN-gamma ELISPOT Numbers/2x105 Splenocytes
b) Gli estratti di pianta contenenti E7
inducono una risposta immunitaria nel
topo
Umorale (anticorpi)
Cellulo-mediata
(ELISPOT su
splenociti di topi vaccinati che
producono Interferon-γγ)
c) I topi vaccinati con gli estratti di pianta sono protetti
dal tumore
% Tum our free anim als
Nb-PVXE7
100
His-E7 + Quil A
80
Nb-PVXw t
60
none
40
20
0
0
7
14
21
28
35
40
50
60
Days after C3 challenge
Tumour volume (cm
3)
d) I topi vaccinati con gli estratti di pianta presentano
ridotta massa tumorale
Nb-PVXE7
8
His-E7 + Quil A
6
Nb-PVXw t
4
none
2
0
7
14
21
28
35
42
Days after C3 challenge
49
56
Il volume
del
tumore è
il 15% di
quello dei
topi non
vaccinati
Brevetto ENEA/ISS/IRE
FRANCONI R. et al. (2001) ‘Vaccini a subunità e
procedimenti per la loro produzione’ PCT/IT02/00354.
Conclusioni
Stabilita una procedura economica ed
efficace per produrre un vaccino antitumorale da pianta basato sulla proteina E7
Lavoro futuro
Comprendere la natura dei macroaggregati
e l’effetto adiuvante dell’estratto di pianta
Aumento dei livelli di espressione e
purificazione della proteina E7 per sua
caratterizzazione biochimica
S. Massa
E. Illiano
E. Benvenuto
O. Bitti
R. Franconi
A. Cirilli
A. Muller
P. Simeone
A. Venuti
ENEA, BIOTEC GEN
Lab. di Virologia,
Istituto Regina Elena, Roma
Prof. S. Duprè
L. Accardi
P. Di Bonito
M. G. Donà
Dip. Biochimica
Università ‘La Sapienza’, Roma
C. Giorgi
Lab. di Virologia
Istituto Superiore di Sanità, Roma
Finanziamenti
PNR AIDS 2000-1-2
Associazione italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) 2001-3
Ricerca Finalizzata Ministero della Salute 2000, 2002
