PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

PRINCIPI DI DIAGNOSTICA
VIROLOGICA
PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA
Generalità
I virus sono parassiti endocellulari obbligati, la particella virale completa
(virione) presenta il genoma costituito da un solo tipo di acido nucleico (DNA
O RNA), un limitato numero di enzimi (tra cui DNA polimerasi o RNA
polimerasi) il tutto racchiuso in un involucro di rivestimento (capside) costituito
da numerose subunità (capsomeri) la cui disposizione assume forme
geometriche ben definite.
Alcuni virioni presentano un ulteriore involucro di natura lipoproteica
(envelope): in alcuni virus (virus influenzale) sulla superficie dell’envelope
sono presenti spicole glicoproteiche con proprietà emoagglutinante e
neuroaminidasica..
PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA
La diagnosi di infezione virale si può attuare mediante:
Ricerca del virus
Ricerca di anticorpi o dei suoi antigeni
Tecniche di amplificazione e/o ibridazione dell’acido nucleico virale
Con l’osservazione microscopico mediante microscopio ottico si possono valutare
aspetti patognomici delle cellule:
cellule giganti
presenza di corpi inclusi
Con la microscopia elettronica è possibile discriminare i caratteri morfologici del
virus colorando i campioni negativamente con acido fosfotungstenico
La metodica più significativa a livello diagnostico è l’isolamento virale in
quanto consente di valutare non solo l’esistenza dell’agente infettante ma
anche di coltivarlo e dimostrare il suo potere patogeno.
PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA
Il prelievo differenziato a seconda dei campioni clinici deve essere raccolto
asetticamente possibilmente nei primi giorni di malattia;
Inviato in contenitore refrigerato in laboratorio
Seminato immediatamente in coltura applicando metodi biologici di
infezione di colture cellulari o in linee cellulari stabili, uova embrionate e/o
inoculazione in animali di laboratorio;
Osservazione dell’effetto citopatico o della formazione di placche di lisi
indotte dal virus, comparsa di lesioni tipiche negli animali o lesioni
macroscopiche su membrane di uova di pollo.
Diagnosi eziologica delle malattie infettive (approcci)
Dimostrazione nel materiale patologico dell’agente infettivo o di suoi componenti
Diagnosi diretta
Dimostrazione nell’organismo infettato di una risposta anticorpale specifica recente
Diagnosi indiretta
Tempi di Diagnosi
Metodi convenzionali (giorni – settimane)
Metodi rapidi (ore – giorni)
Esame microscopico
Ricerca antigeni
Metodiche molecolari
Coltivazione dei virus
I virus sono parassiti endocellulari obbligati pertanto devono:
•
•
Entrare in contatto (aderire)
Penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro
ciclo replicativo
Cellula sensibile e permissiva
Coltivazione dei virus
Coltivazione del virus nell’uovo embrionato
Supporti per colture
cellulari
• fiasche di vetro o plastica
• provette
• piastre con pozzetti di diverso
diametro
•Shell vials (tubi di Leighton)
•Supporti per microcolture
Richiesta di crescita da parte delle cellule
in coltura
Terreni per colture cellulari
Principali componenti
•Terreni di crescita
Con siero bovino fetale al 10 %
•Terreni di mantenimento
Con siero bovino fetale al 3 %
•Terreni serum-free
Soluzione bilanciata di
sali inorganici
Sistema tampone
(bicarbonato/CO2
Carboidrati
Aminoacidi
Vitamine
Ormoni e fattori di
crescita
Proteine e peptidi
Acidi grassi e lipidi
Antibiotici ???
Mantenimento di una coltura cellulare:
•
Cambiamento del mezzo
•
•
•
è necessario sostituire il mezzo periodicamente perché la cellula oltre
sfruttarne le componenti nutrizionali riversa nel mezzo i suoi cataboliti
pH tra 7 e 7.4
Concentrazione cellulare
arresto della crescita o deterioramento
•
Il passaggio
Salvaguardia delle colture cellulari:
•
Instabilità
•
Contaminazioni
La misura delle Unita Formanti Placche (PFU) viene utilizzata per calcolare la
concentrazione di unità virali infettanti.
TIPI DI COLTURE CELLULARI
• Colture primarie
• Colture secondarie (semicontinue, stipiti cellulari)
• Linee cellulari continue
• cellule in monostrato
•Cellule in sospensione (es.emopoietiche)
Allestimento delle colture
Colture primarie
• Derivano direttamente da un tessuto espiantato
•Rappresentative del tessuto d’origine
•Cariotipo diploidee
•Possono contenere tipi di cellule differenti
•Adatte per coltivazione di un elevato numero di
virus
•Laboriose da preparare
•Molto viariabili
cellule di rene di scimmia
cellule di rene di coniglio
Colture semicontinue
(stipiti cellulari)
• Cellule di seconda generazione
•Possono essere sub-coltivate per un
limitato numero di passaggi dopo la
coltura primaria (circa 10-100
passaggi)
•Costituite da un solo tipo di cellule
•Mantengono il fenotipo normale
(cariotipo diploide)
Fibroblasti umani MRC-5
Polmone di embrione umano WI-38.3
Linee cellulari continue
Moltiplicazione di cellule normali in
coltura e possibile origine di linee cellulari
continue
Derivano dai tessuti
neoplastici o da cellule
trasformate e immortalizzate
per mutazione spontanea o
indotta da
• carcinogeni chimici
• Radiazione ionizzante
• Infezione in vitro con
agenti
immortalizzanti
• Cariotipo aneuploide
• Possono essere subcoltivati senza limiti temporali
Linee continue
1952
Hela
(Henrietta Lacks cell line) carcinoma della cervice uterina
KB carcinoma epidermoide della bocca umano
Hep-2
carcinoma epidermoide della laringe umano
VERO
MDCK
BHK
cellule di rene di scimmia
cellule di rene normale di cane
baby hamster kidney
Colture cellulari
I passaggi
(subcolture)
• Staccare le cellule
-Lavare con tripsina-EDTA
-Incubare 3-30 minuti
•Quando il tappeto cellulare diventa opaco risospendere le
cellule nel terreno di coltura
• Suddividere la sospensione cellulare in nuovi recipienti
contenenti terreno di crescita preriscaldato (diluizione 1:3 – 1:5)
• Incubare
•Registrare il numero del passaggio!!!
Colture cellulari
Il congelamento
• Staccare le cellule (tripsina-EDTA)
• Contarle
• Risospendere in terreno da congelamento* a
concentrazione 1X106 per ml
• Distribuire nella criovials
• Incubare per 2 ore a -20°C
• Conservare a -80 °C o in azoto liquido
*siero al 20-40% e DMSO o glicerolo all’1 %
Lo scongelamento
•Preparare il terreno di crescita preriscaldato a 37 °C
• Scongelare rapidamente la sospensione cellulare a 37 °C
• Centrifugare la sospensione cellulare a bassa velocità
• Asportare il sopranatante e risospendere le cellule nel
terreno di crescita
• Trasferire la sospensione nell’apposita fiasca
• Incubare
Fornitori di colture cellulari
ISOLAMENTO DEL VIRUS IN COLTURE CELLULARI
Allestimento delle colture in vitro
Inoculazione del campione
Incubazione
Identificazione e tipizzazione del virus
L’infezione
• Asportare il terreno di coltura
• Lavare le cellule con terreno di coltura senza siero
• Inoculare il campione (pre-trattato)
• Incubare a temperatura indicata
• Asportare l’inoculo
• Aggiungere il terreno di mantenimento
• Incubare
Colture cellulari
Un virus che si replica può produrre:
•Effetto citopatico (CPE). Rigonfiamento delle cellule, formazione di
sincizi- può essere specifico o non specifico
•Emoadsorbimento Le cellule acquisiscono la capacità di attaccarsi ai
globuli rossi dei mammiferi.
La conferma dell’identità dei virus può essere eseguita mediante
neutralizzazione, inibizione dell’emoadsorbimento e prove
d’immunofluorescenza
Effetto citopatico
Formazione di sincizi in colture
cellulari
SINCIZI causati dal virus del morbillo e
EMOADSORBIMENTO di eritrociti
sulla superficie del monostrato
Corpi inclusi da citomegalo
virus (CMV)
Problemi con le colture cellulari
• E’ necessario un lungo periodo di tempo per i risultati
(fino a 4 settimane)
• Spesso una scarsa sensibilità, la sensibilità dipende in
gran parte dalle condizioni del campione
• Sensibili alla contaminazione batterica
• Sensibili alle sostanze tossiche, che possono essere
presenti nel campione
• Molti virus non si replicano nelle colture cellulari (ad.
Virus dell’Epatite B; parvovirus e papillomavirus
Es.
Tecniche diagnostiche classiche
Reazione di fissazione del complemento
Emoagglutinazione
neutralizzazione
Tecniche ancora utilizzate ma largamente soppiantate da metodiche più
rapide e più sensibili:
ELISA
RIA
Test di agglutinazione al lattice
Immunofluorescenza
Ricerca dell’acido nucleico
Fissazione del complemento
Reazione + assenza di emolisi delle
emazie presenza di anticorpo specifico
Reazione – Emolisi delle emazie
Assenza di anticorpo specifico
Emoagglutinazione
•
•
I virus provvisti di emoagglutinine determinano l’agglutinazione delle emazie
La presenza in un campione sierico di anticorpi antiemoagglutinanti inibisce
l’emoagglutinazione virale
Test di emoagglutinazione
La determinazione del
titolo anticorpale può
essere determinata in
provetta o in
micropozzetti;
Si allestiscono diluizioni
seriali del campione di
siero, si aggiungono
alle diluizioni emazie e
virus e si lascia
riposare.
L’inibizione
dell’emoagglutinazione
indicherà la presenza di
anticorpi sierici che
neutralizzano le
emoagglutinine virali. Il
titolo anticorpale è dato
dal reciproco della
maggiore diluizione di
siero in cui si evidenzia
ancora
emoagglutinazione
Tecniche rapide
Applicate per la ricerca di virus o dei suoi
antigeni e per la ricerca di anticorpi (Esame
Indiretto)
Queste metodiche si basano su reazioni antigeneanticorpo e di un sistema di rivelazione.
Queste tecniche si avvalgono dell’uso di
anticorpi monoclonali
Test Immunoenzimatico ELISA
per la determinazione dell’antigene
Viene applicato per la ricerca di antigeni virali o dei corrispondenti anticorpi
Rivela la presenza di antigeni virali
Kit commerciali: virus epatite, rotavirus,
HIV-1,…….
Test Immunoenzimatico ELISA
per la determinazione dell’anticorpo
dosaggio indiretto
Rivela la
presenza di
anticorpi
IMMUNOFLUORESCENZA
La tecnica si basa sulla marcatura con isotiocianato di fluoresceina degli
anticorpi rivelatori e successiva osservazione con microscopio a
fluorescenza.
Metodo Diretto: ricerca eventuali microrganismi in un campione o anche
antigeni intracellulari (Chlamidia, Rickettsiae)
Metodo Indiretto: viene applicato per la ricerca di anticorpi
eventualmente presenti nel siero contro antigeni noti.
Il siero viene messo a contatto con l’antigene noto, in seguito
l’anticorpo marcato (sistema rilevatore) diretto contro la regione
costante della catena pesante degli anticorpi eventualmente presenti
nel siero saggiato.
IMMUNOFLUORESCENZA
Immunofluorescenza diretta
Immunofluorescenza indiretta
Test di Agglutinazione al Lattice
Si utilizzano sferette al lattice la cui superficie è rivestita di antigeni virali
noti
Tecniche per la ricerca dell’acido nucleico virale
Sono metodiche applicate per la ricerca del DNA o RNA virale nel campione da
esaminare, sono altamente sensibili in quanto permettono di rilevare un numero
estremamente basso di virioni .
Sono rapide