Lavoro di diploma di Miguel Fernandez, SSMT, 2008.

Caratterizzazione molecolare del
fenotipo ESBL in
Enterobatteriacee ed altri bacilli
gram negativi di interesse clinico
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB3
Scuola Specializzata Superiore Medico Tecnica
Anno 2007/2008
Istituto Cantonale di Microbiologia
Bellinzona
Responsabili:
Antonella Demarta
Annapaola Caminada
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
2
Indice
1. Riassunto / Abstract
4
2. Introduzione
5
2.1 Le Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
5
2.2 I β-lattamici
6
2.2.1 Resistenze ai β-lattamici
2.3 Le β-lattamasi
2.3.1 ESBL
2.3.2 Meccanismo di resistenza
2.3.3 TEM, SHV, OXA e AmpC
2.4 Obiettivi
7
7
7
8
9
10
3. Materiali e Metodi
11
3.1 Ceppi batterici
11
3.2 Estrazione del DNA batterico
12
3.3 Reazione polimerasica a catena (PCR)
13
3.3.1 PCR Multiplex per i geni blaTEM, blaSHV e blaOXA
3.3.2 PCR per blaAmpC
13
13
3.4 Sequenziamento
14
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
14
14
15
15
Purificazione NucleoSpin Extract II
Reazione di sequenza
Purificazione mediante filtri
Sequenziamento
3.5 Banca dati
4. Risultati
15
16
4.1 Campioni
16
4.2 Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL
17
4.2.1 TEM, OXA e SHV
4.2.2 AmpC
4.3 Sequenziamento
17
19
19
5. Discussione
20
6. Conclusione
21
7. Ringraziamenti
22
8. Bibliografia
23
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
9. Allegati
3
25
9.1 Estrazione del DNA batterico
25
9.2 Skim Milk
26
9.3 Agar Sangue
26
9.4 TE pH 8
26
9.5 Tampone TBE (soluzione stock 10x)
26
9.6 CTAB 10% in 0.7 M di NaCl
26
9.7 Proteinasi K (8.3 mg/ml)
27
9.8 NaCl 5M
27
9.9 SDS 10%
27
9.10 Cloroformio-alcool isoamilico (24:1)
27
9.11 Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1)
27
9.12 Alcool 70%
27
9.13 Loading Buffer 6x
28
9.14 Bromuro d’Etidio (10mg/ml)
28
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
4
1.Riassunto
Abstract
Oggi giorno la produzione di enzimi capaci di
idrolizzare ed inattivare i β-lattamici
rappresenta uno dei meccanismi più
importanti
nella
famiglia
delle
Enterobatteriacee e nei bacilli gram negativi
di interesse clinico.
Questa resistenza è dovuta alla presenza di
uno o più geni di resistenza i quali codificano
per queste proteine inattivatrici.
I geni di resistenza più conosciuti e studiati
sono blaTEM, blaOXA, blaSHV e blaAmpC; ma negli
ultimi tempi sta insorgendo un nuovo gene di
resistenza, il blaCTX-M.
La codificazione da parte di questi geni
comporta una multiresistenza del ceppo
batterico, ma nel caso di una mutazione, il
batterio sarà abile di produrre delle βlattamasi a spettro esteso (ESBL).
Questi patogeni con spettro di resistenza
esteso si riscontrano soprattutto in luoghi di
cura, quali ospedali acuti o case per anziani e
si stima che l’acquisizione varia dai 10 ai 17
giorni dal ricovero, quindi un’ulteriore
problema per il paziente già malato.
Si è deciso quindi di approfondire questi geni
di resistenza caratterizzando 60 ceppi con
fenotipo ESBL isolati dai due nosocomi acuti
del Canton Ticino, l’Ospedale Regionale di
Lugano e l’Ospedale Regionale Bellinzona e
Valli.
Utilizzando la reazione polimerasica a catena
(PCR) si è cercato di determinare la presenza
a livello gnomico di questi geni di resistenza e
secondariamente di evidenziare una possibile
prevalenza sia regionale che nosocomiale. La
reazione di PCR Multiplex ha permesso di
amplificare una regione dei geni blaTEM,
blaOXA e blaSHV; mentre in una reazione
seconda reazione di PCR si è cercato di
evidenziare la presenza del gene blaCMY-2,
descritto come il gene più frequente
appartenente al gruppo eterogeneo AmpC. Si
può notare che un’importante numero di
ceppi ESBL sono appartenenti alla specie E.
coli e si evidenzia la presenza importante di
ceppi batterici presentanti i geni di resistenza
blaTEM e blaOXA sia a livello territoriale che a
livello ospedaliero, risultato che differisce
parecchio da studi precedenti. Evidenziata la
presenza di combinazioni geniche blaTEM e
blaOXA, le quali possono conferire al batterio
uno spettro di resistenza ancora maggiore.
Today the production of enzymes that can
hydrolyze and inactivate β-lactams is the
most important mechanism of resistance in
the family of Enterobacteriaceae and gram
negative bacilli with clinical interest.
The resistance is due by a few mutated
genes of resistance that codify one or more
β-lactamases with an extended spectrum of
resistance (ESBL).
The most know and studied genes of
resistance are blaTEM, blaOXA, blaSHV and
blaAmpC; but now there is a new gene of
resistance, blaCTX-M.
The codification of these genes produce a
multiresistance in the bacteria, and when
begin a bacterial infection it can cause
difficult on the prescription of an antibiotics
therapy.
These multiresistance pathogens are found in
Hospital or in nursing homes and the patient
can contract it in a few days, more or less 1017 days after the admission to hospital.
We decide to study these genes with a
characterisation of 60 strains with a ESBL
phenotype, isolated from two acute Hospital
of our region, Ospedale Regionale di Lugano
and Ospedale Regionale Berllinzona e Valli.
Using the polymerase chain reaction (PCR),
we will found one or more genes of
resistance and we will highlight a regional or
nosocomial prevalence.
The PCR Multiplex has permit to amplify a
region in the genes blaTEM, blaOXA and blaSHV;
and a second PCR reaction highlight the
presence of blaCMY-2, the most described
gene belong in the group of genes AmpC.
We can see the Escherichia coli is the most
isolated strain with ESBL phenotype (66,6%)
from the ICM since 2005. The genes blaTEM
and blaOXA are more highlighted than blaSHV
in the strains isolated from the two acute
Hospital tested.
But from the literature we can read the results
of the study are different from another study
published in other countries; for example in
Spain were find more blaSHV and blaTEM than
blaOXA. We have found a presence of genic
combination blaTEM and blaOXA, that can
produce an higher extended spectrum of
resistance to bacteria.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
5
2.Introduzione
2.1 Le Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi
di interesse clinico
Insieme alle Pastorellacee, alle Vibrionacee ed alle Aeromonadacee, le Enterobatteriacee
appartengono al grande gruppo dei bastoncini gram negativi anaerobi facoltativi.
Le Enterobatteriacee raggruppano molti generi di batteri normalmente presenti a livello
dell’apparato intestinale nell’uomo e negli animali. Alcuni di questi germi sono in grado di
provocare infezioni a diversi organi con manifestazioni cliniche variabili tra lievi a molto
gravi. Le patologie più frequenti causate da un’infezione da parte delle Enterobatteriacee
sono le enteriti non infiammatorie, le enteriti infiammatorie e le manifestazioni sistemiche
delle infezioni intestinali [1].
Questi batteri si presentano come bacilli gram negativi con un diametro che varia tra 0.5 e
1.5 µm ed una lunghezza compresa tra 2 e 4 µm, mobili grazie alla presenza di flagelli o
immobili, nel caso di Shigella e Klebsiella. Possono essere capsulati o acapsulati e
solitamente crescono in anaerobiosi. Questi batteri reagiscono positivamente alla reazione
della catalasi, ma in modo negativo alla reazione dell’ossidasi. Sono in grado di ridurre i
nitriti in nitrati e di fermentare il glucosio con o senza produzione di gas.
La struttura antigenica di questa famiglia presenta gli antigeni O, H, K e F.
La loro patogenicità e virulenza è data da fattori quali fimbrie adesive che conferiscono al
batterio la possibilità di aderire alle mucose, invasine ed enterotossine che portano ad una
perdita massiccia di liquidi da parte della mucosa colonizzata e ad un interferenza nella
funzione di quest’ultima [1].
I generi maggiormente isolati nella pratica clinica sono Escherichia coli e Klebsiella.
Tra i bacilli gram negativi di interesse clinico troviamo oltre alla famiglia delle
Enterobatteriacee i generi Pseudomonas e Acinetobacter.
Appartenente alla famiglia delle Peudomonadacee, Pseudomonas generalmente si
presenta come un bastoncino gram negativo mobile grazie ad uno o più flagelli polari,
batteri strettamente aerobici e in grado di ridurre i nitriti in nitrati. Il sierotipo più importante
di questa specie è lo Pseudomonas aeruginosa. Questi batteri sono normalmente presenti
nell’ambiente, quindi vengono ritrovati nel suolo, nelle acque, sulle piante e come patogeni
commensali nella flora intestinale dell’uomo e degli animali. La loro patogenicità è data
dalla presenza del glicocalice e la presenza di pili. Reagiscono positivamente a reazioni
biochimiche quali ossidasi e catalasi. [1,2]
Il genere Acinetobacter appartiene alla famiglia delle Moraxellacee. Questi batteri si
presentano come bacilli gram negativi, immobili probabilmente per la presenza di fimbrie.
La temperatura ottimale di crescita di questo genere batterico varia tra 33-35°C. Al
momento dell’identificazione attraverso metodi biochimici si osserva la positività alla
catalasi mentre una reazione negativa all’ossidasi. Un’infezione da parte di questo genere
batterico può comportare complicazioni quali setticemie, meningiti, polmoniti, ascessi
cerebrali, ed altre manifestazioni cliniche più deboli [3].
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
6
2.2 I β-lattamici
I β-lattamici sono farmaci che impediscono la sintesi della parete cellulare dei batteri,
interferendo nella formazione dei legami peptidici tra le molecole di peptidoglicano
(presente in particolare nella parete dei batteri gram positivi).
Il primo β-lattamico, molto conosciuto per il suo grande utilizzo nella seconda guerra
mondiale, è la Penicillina, scoperta negli anni 30. Questo antibiotico aveva le capacità di
inibire i batteri resistenti ai sulfonamidi inducendo febbre per aumentare l’effetto
terapeutico [4].
Nel corso degli anni, nuovi β-lattamici sono stati sviluppati in risposta all’insorgere di
resistenze nei batteri.
La resistenza ai β-lattamici da parte dei batteri patogeni risulta essere un grosso problema
a livello mondiale. La principale causa del grande incremento di batteri resistenti é la forte
pressione selettiva esercitata dall’uso massiccio degli antibiotici.
I β-lattamici sono suddivisi in gruppi e sotto-gruppi secondo la loro struttura molecolare
(Tabella1) [5].
Tabella 1: Suddivisione dei β-lattamici [17].
Classe
Penicilline
Sottoclasse
• Penicilline
• Aminopenicilline
• Ureidopenicilline
• Carbossipenicilline
• Peniccillasi
Cefemici
• Amidinopenicilline
• Cefalosporine di prima
generazione
• Cefalosporine di
seconda generazione
• Cefalosporine di terza
generazione
• Cefalosporine di quarta
generazione
• Cefamicine
Figura 1: Struttura dell’anello β-lattamico,
bersaglio delle β-lattamasi per
l’inattivazione [8].
Cefemici (orali)
• Oxacefemici
• Cefalosporine
Monobattamici
• Carbapenemici
Non presenta sottoclassi
Penemici
Francisco Miguel Fernandez Parra
• Carbapenemici
• Penemici
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
7
I β-lattamici possono penetrare all’interno della cellula batterica grazie all’affinità con
alcune proteine di scambio della membrana batterica che permettono il collegamento tra lo
spazio extracellulare e quello intracellulare.
Alcuni β-lattamici presentano un’affinità particolare per enzimi specifici chiamati penicillinbinding proteins (PBPs). Oltre ad avere una funzione di sintesi della parete cellulare questi
enzimi risultano essere un punto di legame con alcuni β-lattamici [6].
2.2.1 Resistenza ai β-lattamici
I meccanismi di resistenza ai β-lattamici sono molteplici ed a seconda delle caratteristiche
del batterio e del bersaglio del β-lattamico si avranno degli effetti dell’antibiotico differenti.
Durante il corso degli anni sono stati scoperti i vari meccanismi di resistenza ai β-lattamici
che sono [4]:
-
la diminuzione dell’assorbimento dell’antibiotico a livello citoplasmatico dato dalla
mutazione delle proteine di membrana che riducono il grado di penetrazione del
beta-lattamico all’interno della cellula;
-
l’alterazione del bersaglio dell’antibiotico causato dalle alterazioni delle proteine
quali le PBPs che portano ad una minore affinità tra il recettore e l’antibiotico;
-
la produzione di enzimi capaci di degradare o alterare il β-lattamico, le betalattamasi che rappresentano la causa principale della resistenza batterica agli
antibiotici β-lattamici.
2.3 Le β-lattamasi
La produzione di enzimi capaci di idrolizzare i β-lattamici rappresenta oggi uno dei
meccanismi più importanti di resistenza a questi antibiotici nei bacilli gram negativi,
soprattutto nelle Enterobatteriacee.
2.3.1 ESBL
Un batterio viene designato come produttore di ESBL al momento in cui l’enzima prodotto
conferisca una resistenza la quale possa idrolizzare oximino-cefalosporine di seconda e
terza generazione. Tra le β-lattamasi, il termine ESBL (Extended spectrum β-lattamase) si
riferisce a [7,8]:
-
geni d’origine che hanno subito mutazioni che conferiscono all’enzima la capacità di
idrolizzare le oximino-cefalosporine. I geni si trovano su plasmidi e sono designati
dalle sigle blaTEM, blaSHV, blaOXA;
-
β-lattamasi simili alle precedenti ma derivanti da altri geni. Designati blaCTX-M e
blaVEB, possono anch’essi trovarsi su plasmidi che spesso trasportano geni di
resistenza anche per altri antibiotici;
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
-
8
enzimi AmpC plasmidici. Questi enzimi sono derivati da geni presenti sul
cromosoma di molti batteri. Conferiscono una resistenza ai β-lattamici molto estesa.
Il termine ESBL si riferisce quindi il momento in cui nel gene di origine avviene una
mutazione che porta quindi ad uno spettro di resistenza più ampio rispetto al gene
d’origine. Da sottolineare però il fatto che non tutte le β-lattamasi possono essere
designate come ESBL visto che molte di queste non presentano mutazione nel gene
d’origine, come ad esempio il blaTEM-1.
Le ESBL più diffuse e studiate in questo lavoro sono TEM, OXA, SHV e AmpC. Questi
enzimi conferiscono al ceppo batterico una multiresistenza che causa difficoltà al medico
nel prescrivere una terapia antibiotica adeguata.
Oltre alla produzione di ESBL esistono altri meccanismi che sono in grado di conferire ai
batteri un fenotipo di resistenza ai β-lattamici simile a quello ESBL. Questi meccanismi
sono: [7,8]
-
l’iperproduzione delle β-lattamasi cromosomiche AmpC (Enterobacter spp.)
-
l’iperproduzione delle β-lattamasi di tipo K1 cromosomiche (Klebsiella oxytoca)
-
la resistenza dovuta alle pompe ad eflusso (P. aeruginosa)
-
la resistenza dovuta a vari meccanismi (Acinetobacter spp.)
Alcune ESBL, come ad esempio le CTX-M, oltre a conferire la multiresistenza ai betalattamici, sono anche in grado di indurre una resistenza ad antibiotici quali chinoloni,
aminoglicosidi e trimethoprim che non appartengono alla famiglia dei β-lattamici [7].
I batteri con fenotipo ESBL positivo sono isolati in modo preponderante in luoghi quali
ospedali acuti o in strutture di soggiorno a lungo termine.
Si stima che nel paziente il tempo di acquisizione di batteri producenti ESBL varia dai 10 ai
17 giorni dal ricovero ed è molto simile al tempo di esposizione di batteri quali MRSA
(Stafilococco aureo meticillino resistente). E proprio per questo motivo che si studiano i
comportamenti di questi batteri, affinché si riduca il rischio di infezione in luoghi di cura,
adottando misure preventive appropriate [9].
Attraverso parecchi studi, si è scoperta una prevalenza degli ESBL localizzata in regioni
specifiche del globo. Alcuni esempi possono essere la scoperta di una prevalenza in
Francia dell’enzima TEM-3, oppure la presenza negli Stati Uniti dell’enzima TEM-10 [10].
Nel corso degli anni la classificazione delle β-lattamasi è stata cambiata svariate volte.
Attualmente si è deciso di utilizzare un metodo di classificazione basato sulla sequenza
aminoacidica in quattro semplici gruppi designati dalla A alla D [11].
2.3.2 Meccanismo di resistenza
In presenza di β-lattamasi, i β-lattamici vengono idrolizzati a livello del sito attivo
dell’enzima grazie alla presenza di un gruppo ossidrile presente nella serina terminale
della catena laterale della β-lattamasi.
Dopo un legame non covalente tra i due, l’anello β-lattamico (Figura 1) viene attaccato da
un gruppo ossidrile libero creando un legame covalente con l’enzima.
A questo punto, mediante una molecola di acqua, avviene l’idrolisi dell’anello del
medicamento liberando l’enzima e inattivando il β-lattamico.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
9
Questo processo mediante serina terminale avviene solo con le β-lattamasi di classe A, C
e D; per le β-lattamasi di classe B l’enzima presenta nel sito attivo uno ione di zinco ma il
principio è simile [7,11,12,13].
Figura 2: Azione delle beta-lattamasi [5]
2.3.3 TEM, SHV, OXA e AmpC
TEM
La prima β-lattamasi plasmatica fu scoperta negli anni sessanta e fu riscontrata in un
batterio presente nell’organismo di un paziente di nome Temoniera, da cui il nome TEM.
Questo gene codifica per una β-lattamasi di classe A [10].
Le β-lattamasi TEM, numerate da TEM-1 a TEM-161, si incontrano maggiormente in
batteri gram negativi e sono responsabili della resistenza all’ampicillina, alle penicilline
nonché alle cefalosporine. Le varianti del gene blaTEM sono la conseguenza di mutazioni
puntiformi a livello nucleotidico che causano la sostituzione di singoli aminoacidi e quindi
la mutazione dell’enzima [14,15].
SHV
Un’altra β-lattamasi importante è SHV ossia Sulphydryl variable.
L’enzima codificato dal gene blaSHV appartiene alla classe A delle β-lattamasi.
Il gene codificante questa β-lattamasi può essere presente sia su plasmidi che sul
cromosoma del batterio ed è spesso riscontrato in ceppi di K. pneumoniae. La maggior
parte di questi enzimi presentano una sostituzione di un aminoacido in posizione 240 (da
una Lisina ad un Glutamato). Questa sostituzione conferisce al batterio il fenotipo ESBL.
Altre variazioni di aminoacidi sono necessarie per conferire le resistenze ad antibiotici
quali ceftazidime o cefotaxime [10].
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
10
OXA
Un altro gene che conferisce resistenza ai β-lattamici appartiene al tipo OXA. A differenza
dei geni blaTEM e blaSHV, questo gene (blaOXA) conferisce al batterio una resistenza
all’ampicillina e alle cefalotine, e grazie alla sua forte attività idrolitica è capace di
idrolizzare pure l’oxacillina e la cloxacillina. Questa beta-lattamasi è riscontrata in ceppi di
E. coli e K. pneumoniae ma la maggior parte di questi enzimi è stata trovata in
Acinetobacter baumanni e P. aeruginosa. Le β-lattamasi del tipo OXA appartengono al
gruppo D.
È però anche in questo caso necessaria una mutazione del gene per conferire al ceppo
batterico un fenotipo ESBL [10].
AmpC
Un altro tipo di β-lattamasi è rappresentata da AmpC, che si presenta come un gruppo
eterogeneo di geni che possono essere localizzati sul cromosoma o sul plasmidio. Molti
ceppi appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriacee presentano uno di o più geni
AmpC, i quali però vengono espressi soprattutto in ceppi di K. pneumoniae. Appartenente
alla classe C, l’enzima codificato può causare resistenza alle cefalosporine ed alle
penicilline. La particolarità, che rende poi così difficile identificare la presenza di una di
queste β-lattamasi e quindi del gene, é che non viene inibita dall’acido clavulanico, a
differenza di altre β-lattamasi a spettro esteso, dando così risultati falsamente negativi [6].
2.4 Obiettivi
La produzione di β-lattamasi a largo spettro rappresenta il meccanismo di resistenza ai βlattamici più importante nelle Enterobatteriacee; batteri enterici produttori di ESBL sono
sempre più diffusi.
Il fenotipo ESBL è messo in evidenza all’ICM tramite un sistema automatizzato (Phoenix,
BD) e/o l’analisi delle reazioni di sensibilità/resistenza (antibiogramma) a specifici
antibiotici.
Seguendo le linee direttive del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute™), il
fenotipo ESBL viene confermato grazie alla valutazione dell’effetto sinergico della
combinazione antibiotico+inibitore di β-lattamasi. Questa procedura non permette però di
individuare l’enzima e rispettivamente il gene responsabile del fenotipo osservato.
Lo scopo del lavoro era la caratterizzazione a livello molecolare del fenotipo ESBL, in
batteri identificati all’ICM come produttori di enzimi ESBL. Inoltre era nostra intenzione
rilevare la prevalenza dei diversi geni di resistenza a livello regionale (Canton Ticino) ed
eventualmente a livello di struttura ospedaliera.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
11
3. Materiali e Metodi
3.1 Ceppi batterici
Per questo studio sono stati utilizzati 60 ceppi con fenotipo ESBL positivo provenienti dai
due nosocomi più importanti della regione, Ospedale Regionale Bellinzona e Valli (30
ceppi) e Ospedale Regionale di Lugano (30 ceppi) (Tabella 2).
Tabella 2: Numero d’identificazione, specie e provenienza dei ceppi batterici testati.
Ceppo
ESBL 04/07
ESBL 05/07
ESBL 10/07
ESBL 12/07
ESBL 13/07
ESBL 14/07
ESBL 16/07
ESBL 21/07
ESBL 22/07
ESBL 23/07
ESBL 32/07
ESBL 40/07
ESBL 48/07
ESBL 51/07
ESBL 55/07
ESBL 58/07
ESBL 74/07
ESBL 88/07
ESBL 90/07
ESBL 91/07
ESBL 93/07
ESBL 94/07
ESBL 132/06
ESBL 156/06
ESBL 162/06
ESBL 164/06
ESBL 165/06
ESBL 168/06
ESBL 170/06
ESBL 179/06
ESBL 100/07
ESBL 11/07
ESBL 27/07
ESBL 33/07
ESBL 35/07
ESBL 43/07
ESBL 47/07
ESBL 50/07
ESBL 56/07
ESBL 71/07
ESBL 73/07
ESBL 84/07
ESBL 87/07
ESBL 89/07
Francisco Miguel Fernandez Parra
Batterio
K. pneumoniae
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
K. oxytoca
E. coli
Salmonella spp
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
P. mirabilis
E. coli
A. spp
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
K. oxytoca
P. aeuroginosa
E. coli
Bacc. Gram - NE
K. oxytoca
E. coli
K. pneumoniae
E. coli
K. pneumoniae
E. coli
Provenienza
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
Ceppo
ESBL 06/06
ESBL 105/05
ESBL 125/05
ESBL 140/05
ESBL 149/06
ESBL 162/05
ESBL 176/06
ESBL 194/06
ESBL 198/06
ESBL 202/06
ESBL 21/05
ESBL 33/05
ESBL 72/06
ESBL 93/05
ESBL 95/06
ESBL 99/05
Batterio
E. coli
E. coli
K. oxytoca
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. sakazakii
E. clocae
E. coli
E. coli
12
Provenienza
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
I ceppi sono stati selezionati unicamente seguendo un ordine temporale e di provenienza,
senza tenere conto di altri criteri come specie batterica, etc.
I ceppi batterici testati determinati dal laboratorio di routine dell’istituto come produttori di
ESBL sono stati congelati a -80°C nel terreno di conservazione Skim Milk (BBL, Allegato
9.2).
I ceppi sono poi stati scongelati e coltivati su piastre non selettive Agar Sangue di
produzione propria dell’Istituto (Oxoid, Allegato 9.3) ed incubate a 37°C per 24 ore per
permetterne la crescita. Il processo di coltura è stato ripetuto due volte per avere una
coltura sicuramente pura proveniente da un'unica colonia.
3.2 Estrazione del DNA batterico
Il metodo utilizzato per l’estrazione del DNA batterico totale è stato quello basato
sull’estrazione classica Fenolo-Cloroformio (Allegato 9.1).
In breve, dopo lisi batterica grazie ad un detergente, le proteine vengono (in parte)
degradate dalla proteinasi K. I detriti di parete, i polisaccaridi e le proteine rimanenti
precipitano con la centrifugazione insieme alla soluzione CTAB. Il DNA viene poi purificato
e fatto precipitare grazie all’isopropanolo.
Si è controllato lo stato del DNA caricando gli estratti su di un gel Agarosio 0,8%. La
visualizzazione delle bande è permessa grazie alla presenza di Bromuro d’Etidio (Allegato
9.14) aggiunto direttamente al gel e l’aggiunta al campione del Loading Buffer 6X (Allegato
9.13). La visualizzazione su gel ha permesso anche di stimare la concentrazione del DNA,
necessarie per stabilire il volume da utilizzare nelle reazioni di PCR.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
13
3.3 Reazione polimerasica a catena (PCR)
3.3.1 PCR Multiplex per i geni blaTEM, blaSHV e blaOXA
Per la messa in evidenza dei geni codificanti per TEM, SHV e OXA si è usata una PCR
Multiplex che permette l’amplificazione di diversi frammenti di DNA batterico allo stesso
tempo.
Nella reazione sono state utilizzate 3 coppie di primers per amplificare i geni blaTEM (516
bp), blaOXA (619 bp) e blaSHV (392 bp) (Tabella 3).
Per la PCR Multiplex è stato utilizzato un kit PCR Multiplex (Qiagen) seguendo le
indicazioni forntite.
A 25 µl di QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, sono stati aggiunti 5 µl di 10x Primers Mix
(ottenuti pipettando 10 µl di ogni primer con una concentrazione iniziale di 100 µM ad un
volume di 470 µl di TE), 15 µl di acqua RNase Free ed infine 5 µl di DNA estratto,
raggiungendo un volume totale di 50 µl.
A differenza delle condizioni del termociclatore presenti nell’articolo di riferimento [14],
nella nostra reazione è stata applicata una denaturazione iniziale di 15 minuti a 95°C, per
permettere l’attivazione della HotStar Taq Polimerasi.
Successivamente sono stati applicati 32 cicli comprendenti la denaturazione a 94°C per 30
secondi, l’ibridazione dei primers ad una temperatura di 54°C per 30 secondi,
l’elongazione da parte della Taq Polimerasi a 72°C per 1 minuto ed infine un’elongazione
finale di 10 minuti a 72°C [14].
Sul gel sono stati caricati 10 µl di amplificato e 3 µl di Loading Buffer 6X .
Per l’interpretazione dei risultati è stato caricato in parallelo un marcatore di taglia da 50
bp (DNA molecular weight marker XIII, Roche molecular biochemicals).
I prodotti della PCR Multiplex sono stati fatti migrare in un gel d’agarosio all’1,5%
(AgarosioLE, Roche) contenente Bromuro d’Etidio, ad un voltaggio di 100 V per
approssimativamente 1 ora e 30 minuti e visualizzati grazie ad il transilluminatore BioDocIt System (UVP, BioImaging Systems).
3.3.2 PCR per il gene blaAmpC
In questa reazione di PCR é stata usata la coppia di primers AmpF e AmpR (Tabella 3), in
grado di amplificare una regione specifica del gene blaCMY-2 di grandezza pari a 630 bp
[16].
Per un volume totale di 50 µl di reazione sono stati aggiunti 25 µl di PCR Master Mix
(Qiagen), 1,5 µl di primer AmpF (10 µM), 1,5 µl di AmpR (10 µM), 21 µl di acqua RNAse
Free e 5 µl di DNA estratto.
Le condizioni del termociclatore utilizzate sono state 35 cicli comprendenti 1 minuto di
denaturazione a 94°C, 1 minuto di ibridazione a 60°C, 1 minuto di elongazione a 72°C ed
infine un elongazione finale di 10 minuti a 72°C [16].
I risultati sono stati visualizzati caricando 10 µl di amplificato e 3 µl di Loading Buffer 6X su
gel agarosio 1,5% e interpretati grazie al marcatore di taglia da 100 bp (DNA molecular
weight XIV, Roche molecular biochemicals). Il gel è stato fatto migrare per circa 1 ora e
mezza ad un voltaggio di 100 V.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
14
Tabella 3: Sequenze primers utilizzati nelle reazioni di PCR [7,6].
3.4 Sequenziamento
Terminata la PCR Multiplex, frammenti con lunghezza non conforme con i risultati attesi
nella visualizzazione su gel d’agarosio sono stati sequenziali, allo scopo di confermare la
presenza del gene di resistenza.
3.4.1 Purificazione NucleoSpin Extract II
Prima di procedere al sequenziamento gli amplicon sono stati purificati con il kit
NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) per togliere primers, dNTP e Taq Polimerasi in
eccesso.
3.4.2 Reazione di sequenza
Con gli amplificati purificati si è poi continuato con la reazione di sequenza, che ha
permesso di amplificare unicamente un braccio del DNA per poi determinarne la
sequenza.
Si sono pipettati 3 µl di BigDye Terminator v1.1 (Applied Biosystems), 1.5 µl di Buffer 5X
BigDye, 2.4 µl di primers specifico ad una concentrazione finale di 1 µM, 7.1 µl di acqua
sterile ed infine 1 µl di amplificato purificato per arrivare ad un volume complessivo di 15 µl
di reazione.
Al termociclatore sono stati applicati una denaturazione iniziale a 96°C per 1 minuto, 25
cicli che comprendono una denaturazione a 96°C per 10 secondi, l’ibridazione a 50°C per
5 secondi ed infine un elongazione a 60°C per 4 minuti. Finita la reazione di sequenza il
campione è stato portato a 4°C per la conservazione.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
15
3.4.3 Purificazione mediante filtri
Terminata la reazione di sequenza, campioni sono stati purificati con un processo
osmotico, caricando i 15 µl di reazione di sequenza su filtri in Nitrocellulosa con spessore
pari a 0.025 µm (Millipore) poggiati in TE a pH 8 in una scatola di petri per
complessivamente 2 ore.
3.4.4 Sequenziamento
Terminato il tempo della seconda purificazione i campioni sono stati recuperati dal filtro (8
µl) ed aggiunti infine nelle provette di reazione insieme a 12 µl di HI-DI Formamide
(Applied Biosystems).
Infine per determinare la sequenza è stato utilizzato l’apparecchio ABI Prism 310 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems).
3.5 Banca dati
Le sequenze ottenute sono state corrette e processate grazie a due software: EditSeq
(DNASTAR) per la correzione e Mega 3.1 per l’allineamento con sequenze conosciute
[17].
L’appartenenza ad uno dei tipi di beta-lattamasi è stata determinata con l’inserimento delle
sequenze nel sistema di ricerca BLAST (Basic Local Alignement Search Tool), che
comprende banche dati quali GenBank, EMBL e DDBJ+PDB.
Le sequenze sono state messe a confronto con quelle già presenti nelle diverse banche
dati del sistema di ricerca, e l’appartenenza è stata data in base alla percentuale di
omologia riscontrata dal sistema di ricerca confrontando entrambe le sequenze.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
16
4. Risultati
4.1 Campioni
Per questo studio sono stati utilizzati 36 ceppi isolati nel 2007, 16 isolati nel 2006 e 8 nel
2005 provenienti dai due nosocomi: l’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli e l’Ospedale
Regionale di Lugano.
Tutti i ceppi facevano parte della collezione dell’ICM e sono stati identificati come
produttori di β-lattamasi a largo spettro tramite metodi fenotipici.
Come mostra la figura 3 i ceppi testati appartengono in gran parte alla specie E. coli, che
raggrupa il 66,6% dei ceppi analizzati (Figura 3 e Tabella 4). L’86,6% degli stipiti a
fenotipo ESBL analizzati appartenevano alla famiglia delle Enterobatteriacee. Il restante
13,3% è suddiviso tra Acinetobacter spp. (7 ceppi), P. aeruginosa ed un bacillo gram
negativo non appartenente alle Enterobatteriacee.
Salmonella spp
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeuroginosa
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella oxytoca
ORBV
Enterobacter sakazakii
ORL
Enterobacter cloacae
Escherichia coli
Bac. gram negativi non Enterobatteriacee
Acinetobacter spp
Acinetobacter baumanni
0
5
10
15
20
25
Numero di ceppi
Figura 3: Ripartizione delle specie dei ceppi testati secondo provenienza.
Francisco Miguel Fernandez Parra
Batterio
ORL
ORBV
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
17
Tabella 4: Ripartizione delle specie dei ceppi testati secondo provenienza in
13,33%
6,67%
Acinetobacter baumanni
percentuale.
3,33%
0%
Acinetobacter spp
0%
3,33%
Bacillo Gram negativi non Enterobatteriacee
70% 63,30%
E. coli
0%
3,33%
Enterobacter cloacae
0%
3,33%
Enterobacter sakazakii
3,33%
10%
Klebsiella oxytoca
3,33%
6,67%
Klebsiella pneumoniae
0%
3,33%
Pseudomonas aeuroginosa
3,33%
0%
Proteus mirabilis
3,33%
0%
Salmonella spp
4.2 Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL
4.2.1 TEM, OXA e SHV
Tramite la PCR Multiplex tutti i ceppi sono stati testati per determinare la presenza e il tipo
di gene di resistenza.
Infatti 48 ceppi batterici (pari all’80%) selezionati sui 60 analizzati nello studio
presentavano almeno uno di questi geni di resistenza (Tabella 4).
Il risultato è stato dedotto dalla lunghezza del frammento amplificato dopo corsa
elettroforetica su gel d’agarosio all’1,5% (Figura 4).
Figura 4: Gel d’agarosio all’1,5% degli amplicon ottenuti con PCR Multiplex.
Linee: DNA molecular weight marker XIII (Roche molecular biochemicals);
ESBL 95/06, E. coli positivo per blaOXA proveniente dall’ORBV; ESBL 156/06,
P. mirabilis positivo per blaTEM proveniente dall’ORL; K+ TEM, E. coli (D9)
controllo positivo blaTEM; K+ OXA, S. typhimurium (D8) controllo positivo per
blaOXA; K+ SHV, K. pneumoniae controllo positivo per blaSHV.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
18
In alcuni casi, per frammenti poco visibili e/o di lunghezza non conforme, si è proceduto ad
una verifica tramite sequenziamento. La presenza ed il tipo di gene di resistenza sono stati
confermato per 19 amplificati.
Solo in 12 ceppi con fenotipo ESBL dei 60 analizzati (ossia il 20 %) non è stato possibile
mettere in evidenza nessuno dei geni di resistenza testati.
La ricerca dei geni di resistenza blaTEM, blaSHV e blaOXA è infatti risutata negativa in 4
Acinetobacter spp, 3 K. oxytoca, 2 E. coli, 1 P. aeruginosa, 1 K. pneumoniae e 1 bacillo
gram negativo non appartenente alla famiglia delle Enterobatteriacee.
La distribuzione dei tre geni di resistenza secondo luogo d’origine, che è rappresentata
nella Figure 5, mostra anche la prevalenza regionale; essendo in relazione i due
nosocomi. La Figura 6 invece mostra invece la frequenza delle combinazioni geniche
riscontrate nei due ospedali acuti.
20
18
16
14
12
ORL
10
ORBV
8
6
4
2
0
blaTEM
blaOXA
blaSHV
Figura 5: Prevalenza genica secondo l’origine dei ceppi batterici.
30
25
20
ORL
15
ORBV
10
5
0
blaTEM-blaOXA
blaTEM-blaSHV
blaTEM-blaOXA-blaSHV
Figura 6: Combinazioni geniche
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
19
4.2.2 AmpC
I primers selezionati all’inizio del lavoro permettevano di determinare la presenza di una
variante genica del gruppo eterogeneo di geni producenti β-lattamasi AmpC, ossia blaCMY2, che risulta essere più frequente per la produzione di questa beta-lattamasi [13].
Tutti i ceppi batterici analizzati non presentavano la forma genica blaCMY-2.
4.3 Sequenziamento
Nessuno degli amplificati ottenuti con la PCR per la detezione del gene di resistenza
blaCMY-2 sottoposti a sequenziamento ha permesso di evidenziare omologie con le
sequenze presenti nelle banche dati.
Tabella 4: Tabella risultati ottenuti grazie alla PCR Multiplex e provenienza dei ceppi batterici analizzati.
Ceppo
ESBL 04/07
ESBL 05/07
ESBL 10/07
ESBL 12/07
ESBL 13/07
ESBL 14/07
ESBL 16/07
ESBL 21/07
ESBL 22/07
ESBL 23/07
ESBL 32/07
ESBL 40/07
ESBL 48/07
ESBL 51/07
ESBL 55/07
ESBL 58/07
ESBL 74/07
ESBL 88/07
ESBL 90/07
ESBL 91/07
ESBL 93/07
ESBL 94/07
ESBL 132/06
ESBL 156/06
ESBL 162/06
ESBL 164/06
ESBL 165/06
ESBL 168/06
ESBL 170/06
ESBL 179/06
ESBL 100/07
ESBL 11/07
ESBL 27/07
ESBL 33/07
ESBL 35/07
ESBL 43/07
ESBL 47/07
ESBL 50/07
ESBL 56/07
ESBL 71/07
ESBL 73/07
ESBL 84/07
ESBL 87/07
Batterio
K. pneumoniae
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
K. oxytoca
E. coli
Salmonella spp
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
P. mirabilis
E. coli
A. spp
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
K. oxytoca
P. aeuroginosa
E. coli
Bacc. Gram - NE
K. oxytoca
E. coli
K. pneumoniae
E. coli
K. pneumoniae
Francisco Miguel Fernandez Parra
TEM
+
n
+
+
+
+
+
n
n
+
n
+
n
n
n
n
+
n
+
+
+
+
+
+
n
n
+
+
+
+
+
+
n
+
n
n
+
n
n
n
n
+
+
OXA
n
+
n
n
n
n
+
n
+
+
+
+
n
+
n
+
n
+
n
+
+
+
n
n
+
n
+
+
+
+
+
n
+
n
n
n
+
n
n
+
n
n
n
SHV
+
n
n
n
n
n
n
n
n
+
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
Provenienza
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORL
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
Ceppo
ESBL 89/07
ESBL 06/06
ESBL 105/05
ESBL 125/05
ESBL 140/05
ESBL 149/06
ESBL 162/05
ESBL 176/06
ESBL 194/06
ESBL 198/06
ESBL 202/06
ESBL 21/05
ESBL 33/05
ESBL 72/06
ESBL 93/05
ESBL 95/06
ESBL 99/05
Batterio
E. coli
E. coli
E. coli
K. oxytoca
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
A. baumanni
E. coli
E. sakazakii
E. clocae
E. coli
E. coli
TEM
+
n
n
+
n
+
+
+
+
+
n
n
n
+
+
n
n
OXA
+
n
n
n
n
n
n
+
+
+
+
n
n
+
n
+
+
SHV
n
n
n
n
+
n
n
n
n
n
n
n
+
+
n
n
n
20
Provenienza
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
ORBV
5. Discussione
Innanzitutto il fenotipo ESBL è espresso in modo preponderante nelle Enterobatteriacee
ed in particolare negli E. coli.
Tale fenotipo ha potuto essere associato ad almeno un gene di resistenza nell’80% dei
ceppi analizzati.
Il metodo applicato all’ICM per la diagnosi fenotipica dei batteri produttori di ESBL [18] ha
dato risultati conformi all’analisi molecolare nella maggior parte dei ceppi appartenenti alle
Enterobatteriacee. Infatti solo in 6 ceppi (corrispondenti all’11,7%) appartenenti a questa
famiglia non è stato possibile evidenziare la presenza dei geni di resistenza ricercati.
In particolare, sono risultati negativi 3 stipiti della specie K. oxytoca e uno della specie K.
pneumoniae. Dalla letteratura [7] è noto che le Klebsielle (in particolare la K. oxytoca)
possono presentare un fenotipo ESBL a causa della produzione di una β-lattamasi di tipo
K1 o per una iperproduzione di un enzima AmpC, probabilmente una variante non
evidenziabile con la nostra procedura. L’iperproduzione di AmpC potrebbe essere una
spiegazione anche nel caso di 2 E. coli ESBL positivi nei quali non sono stati evidenziati
geni blaTEM, blaSHV o blaOXA.
Tra i ceppi analizzati, 7 sono stati identificati come Acinetobacter spp ed uno come P.
aeruginosa, quindi non appartenenti alla famiglia delle Enterobatteriacee.
Il fenotipo ESBL evidenziato in tutti gli 8 ceppi sopracitati (corrispondenti al 13,3% dei
ceppi totali) è però stato confermato con il reperimento di almeno un gene di resistenza
solo in 2 Acinetobacter baumannii. Anche per queste specie il fenotipo ESBL può essere
dovuto ad altri meccanismi quali la presenza di pompe a eflusso e/o una diminuita
permeabilità della membrana.
È comunque da sottolineare che la metodologia indicata dal CLSI eseguita all’ICM è poco
affidabile nel caso di batteri non appartenenti alle Enterobatteriacee come indicato da molti
lavori scientifici e dal CLSI stesso [19].
Il gene blaAmpC non è stato individuato in nessuno degli stipiti analizzati. Bisogna però
ricordare che AmpC può essere sintetizzato a partire da un gruppo eterogeneo di geni.
Nel nostro studio ci siamo limitati alla ricerca di quello più frequentemente descritto, CMY2. È quindi ipotizzabile che l’uso di altri primers con un gene target diverso appartenente al
gruppo eterogeneo AmpC avrebbe potuto dare risultati diversi.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
21
Nella collezione di ceppi analizzati non è stato possibile individuare una prevalenza dei
geni reperiti dipendente dall’origine dei ceppi. Il gene blaTEM è stato evidenziato con
maggior frequenza sia negli stipiti provenienti dall’ORL che da quelli dell’ORBV. Anche gli
stipiti con più di un gene di resistenza erano presenti nei due sottogruppi.
A livello regionale è stato possibile osservare una maggior frequenza dei geni del tipo
blaTEM, seguita da quelli del tipo blaOXA mentre i geni blaSHV risultano essere molto meno
frequenti. Invece secondo la letteratura, fino al 1990 i geni maggiormente isolati in ceppi
batterici sono stati blaTEM e blaSHV[15,19]; a scapito dei geni blaOXA [14], cosa che
dimostrata da tale studio non corrisponde alla situazione nel territorio ticinese.
La combinazione genica evidenziata con maggior frequenza è stata blaTEM-blaOXA; la quale
può influire maggiormente sulla scelta della terapia antibiotica da parte del medico, vista la
produzione di due β-lattamasi con spettro di resistenza esteso.
In un ceppo è pure stato possibile evidenziare la presenza simultanea di 3 geni indicati
sopra. Si tratta di un Enterobacter sakazakii isolato da un campione clinico proveniente
dall’Ospedale Regionale Bellinzona e Valli.
Il riscontro del gene blaOXA risulta aumentato in ceppi di E. coli. Questo risultato differisce
parecchio dal resto del mondo, visto che in altri paesi questi geni sono stati isolati
maggiormente in ceppi come P. aeruginosa o A. baumannii [15].
6. Conclusione
In conclusione questo studio ha dimostrato come la maggior parte dei bacilli gram negativi
di interesse clinico con fenotipo ESBL dei due ospedali acuti testati siano E. coli. Inoltre si
è evidenziata una diverza tendenza in Ticino riguardo la prevalenza dei geni di resistenza
testati. Un ulteriore gene di resistenza da testare per la continuazione dello studio sarebbe
il blaCTX-M visto il suo grande incremento nel corso degli ultimi anni. [19]
Un’altra possibile continuazione del lavoro di diploma sarebbe la ricerca di nuovi primers
che permettano l’amplificazione completa dei geni blaTEM, blaSHV e blaOXA; questo per
determinare non una prevalenza genica, bensì una possibile prevalenza delle varianti dei
3 geni testati con la PCR Multiplex.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
22
7. Ringraziamenti
Innanzitutto ringrazio il dottor Orlando Petrini, direttore dell’Istituto Cantonale di
Microbiologia, per avermi permesso di effettuare il lavoro di diploma presso l’istituto.
I miei ringraziamenti vanno anche alla dottoressa Antonella Demarta, microbiologa, che mi
ha seguito durante tutto lo studio dandomi consigli di ogni genere; come pure alla
dottoressa Cinzia Benagli per il suo aiuto durante la redazione della parte scritta.
Un ringraziamento particolare è rivolto verso il Tecnico in Analisi Biomediche AnnaPaola
Caminada che mi ha aiutato durante lo svolgimento della parte pratica e non,
sopportandomi con tanta pazienza e dandomi anche un supporto morale durante i
momenti bui del lavoro.
Altri ringraziamenti vanno al direttore della Scuola Superiore Medico Tecnica Andrea
Boffini, alle docenti Sonja Marci e Daniela Marcacci, al docente Giovanni Togni per il
supporto metodologico riguardante il lavoro di diploma.
Ringrazio infine, non per meno importanza, la docente Michaela Zenger per avermi
seguito durante tutta la durata del lavoro come tutor scolastico e Andrea Carluccio, mio
compagno di classe.
Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
23
8. Bibliografia
[1]
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Pseudomonadaceae, Genus I. Pseudomonas), in: D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley,
G. M. Garrity. 2005. Bergey’s manual of sistematic bacteriology. 2nd edition, Springer,
Volume 2:323-379.
[3]
Garrity G. M., J. A. Bell, T. Lilburn, Order IX Pseudomonadales (Family II. Moraxellaceae,
Genus II. Acinetobacter), in: D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley, G. M. Garrity. 2005.
Bergey’s manual of sistematic bacteriology. 2nd edition, Springer, Volume 2:425-437.
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Siu L. K.. 2001. Antibiotics: Action and resistance in gram-negative bacteria. J. Microbiol.
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Editions C. et R., Quatrième Partie, 397-403.
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Francisco Miguel Fernandez Parra
TAB 3 – SSMT
Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
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9. Allegati
9.1 Estrazione del DNA batterico
Materiale:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
TE pH 8 (allegato 9.4)
Proteinasi K (allegato 9.7)
SDS 10% (allegato 9.9)
NaCl 5 M (allegato 9.8)
CTAB 10 % (allegato 9.6)
Cloroformio-alcool isoamilico (allegato 9.10)
Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (allegato 9.11)
Alcool 70% (allegato 9.12)
Procedimento:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Prelevare da piastra Agar Sangue un’ansa di colonie e risospendere in 558 µl di TE.
Aggiungere 30 µl di SDS 10% e 12 µl di Proteinasi K e miscelare sul vortex.
Incubare ad una temperatura di 37°C fino al raggiungimento di una soluzione limpida,
complessivamente 1 ora.
Aggiungere 100 µl di NaCl 5 M e miscelare nuovamente.
Aggiungere 80 µl di CTAB 10% e mescolare manualmente. Procedere quindi
un’incubazione a 65°C per 10 minuti.
Aggiungere 700 µl di Cloroformio-alcool isoamilico, e mescolare molto bene fino ad
avere una soluzione uniforme e centrifugare 10 minuti a 13'000 rpm.
Trasferire 500 µl di sopranatante in un nuovo contenitore ed aggiungere 500 µl di
Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico. Mescolare molto bene e centrifugare 10 minuti a
13'000 rpm.
Trasferire 200 µl di sopranatante in un nuovo contenitore e aggiungere 120 µl di
Isopropanolo freddo. Centrifugare per 13 minuti a 13'000 rpm a 4°C.
Togliere il sopranatante evitando di perdere il pellet e aggiungere 300 µl di Alcool 70%
ed effettuare un movimento oscillatorio. Centrifugare per 5 minuti a 13'000 rpm.
Lasciar asciugare il pellet presente all’interno degli Eppendorf, utilizzando lo SpeedVac
Concentrator (Savant) oppure tenendo il contenitore aperto e capovolto per all’incirca 1
ora.
Infine risospendere il pellet in 80 µl di TE pH 8.
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Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
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9.2 Skim Milk
Materiale:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
10 g di Skim milk, BBL;
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti;
10 ml di Calf serum, Sigma;
20 ml di Glicerolo, Fluka;
70 ml di acqua demineralizzata.
9.3 Agar Sangue
Materiale:
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
312 g di Columbia Agar Base, Oxoid;
7600 ml di acqua demineralizzata;
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti;
400 ml di sangue di montone, Mischler.
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
ƒ
1,211 g di TRIS Base, Fluka;
0,372 g di EDTA;
Portare a volume 1000 ml di acqua demineralizzata;
Aggiustare pH con NaOH o rispettivamente HCl;
Sterilizzare a 121°C per 15 minuti.
9.4 TE pH 8
Materiale:
9.5 Tampone TBE (soluzione stock 10x)
Materiale:
In un 1000 ml di acqua demineralizzata:
ƒ 108 g di Tris Base, Fluka;
ƒ 55 g di Acido Borico, Fluka;
ƒ 40 ml di EDTA 0,5 M a pH 8
9.6 CTAB 10% in 0,7 M di NaCl
Materiale:
ƒ 10 g di CTAB, Merck;
ƒ 100 ml di NaCl 0,7 M;
ƒ Sterilizzare a 121°C per 15 minuti.
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Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
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9.7 Proteinasi K (8,3 mg/ml)
Materiale:
ƒ 25 mg di proteinasi K, Sigma;
ƒ 3 ml di acqua demineralizzata e sterilizzata.
9.8 NaCl 5 M
Materiale:
ƒ 29,22 g di NaCl, Fluka;
ƒ Portare a volume di 100 ml con acqua demineralizzata.
9.9 SDS 10%
Materiale:
ƒ 10 g di SDS, Fluka, Sigma;
ƒ Portare a volume di 100 ml con acqua demineralizzata,
ƒ HCl concentrato per portare la soluzione a pH 7,2;
ƒ Filtrare con un filtro a 0,2 µm.
9.10 Cloroformio-alcool isoamilico (24:1)
Materiale:
ƒ
ƒ
96 ml di Cloroformio, Merck;
4 ml di alcool isoamilico, Fluka.
9.11 Fenolo-cloroformio-alcool isoamilico (25:24:1)
Materiale:
ƒ 50 ml di Fenolo, Fluka;
ƒ 48 ml di Cloroformio, Merck;
ƒ 2 ml di alcool isoamilico, Fluka.
9.12 Alcool 70%
Materiale:
ƒ 70 ml di Etanolo assoluto;
ƒ 30 ml di acqua demineralizzata.
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Caratterizzazione molecolare del fenotipo ESBL in Enterobatteriacee ed altri bacilli gram negativi di interesse clinico
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9.13 Loading Buffer 6x
Materiale:
ƒ 0.25% mg di Blu di Bromotimolo, Merck;
ƒ 0.25% di xylene cyanol;
ƒ 30% di Glicerolo in acqua, Fluka;
9.14 Bromuro d’Etidio (10 mg/ml)
Materiale:
ƒ 2 g di EtBr, Sigma;
ƒ 200 ml di acqua demineralizzata.
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