Prof. Maria Nicola GADALETA
E-mail: [email protected]
Facoltà di Scienze Biotecnologiche
Corso di Laurea in
Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche
Biochimica e Biotecnologie Biochimiche
DISPENSA N. 4
AMMINOACIDI
α-AMMINOACIDI PROTEICI O STANDARD
Gli aminoacidi (AA) presenti nella cellula possono essere il prodotto di idrolisi
delle proteine (αAA proteici o standard; αAA rari o non standard) o metaboliti
liberi (AA non proteici).
Gli α-amminoacidi hanno proprietà strutturali comuni
M.N. Gadaleta
CLASSIFICAZIONE BIOCHIMICA DEI 20 AMMINOACIDI STANDARD
R non polare (o idrofobico) (8-9 AA)
Sono i meno solubili in acqua; il meno idrofobico è l’alalnina.
*
AMMINOACIDO
(Glicina) (P.M. 75)
Alanina
Valina
Leucina
Isoleucina
° Prolina
Metionina
Fenilalanina
Triptofano (P.M. 204)
##
SIMBOLI
Gly
Ala
Val
Leu
Ile
Pro
Met
Phe
Trp
GRUPPO
G
A
V
L
I
P
M
F
W
Gruppo imminico
Gruppo fenile
Indolo
* per Tyr vedi AA con R polare non carico
##
la Glicina avendo come R solo H è in alcuni casi inserito fra gli AA con R non polare (idrofobico), in altri fra gli
amminoacidi con R polare non carico (idrofilico).
° L’anello piridinico comprende sia Cα che NH2.
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R polare non carico a pH neutro (idrofilico) (6-7 AA)
Sono più solubili dei precedenti; R può formare legami H con H2O.
I più polari (Cys e Tyr*) a pH 7 sono debolmente ionizzati.
AMMINOACIDO
##
(Glicina)
Serina
Treonina
Cisteina
Tirosina*
Asparagina
Glutamina
Gly
Ser
Thr
Cys
Tyr
Asn
Gln
* R aromatiico: vedi pagina precedente
G
S
T
C
Y
N
Q
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R polare carico a pH 7 (idrofilici) (5 AA)
Tutti con R completamente ionizzato a pH 6-7, negativi o positivi, tranne His che ha pKR ~ 6.
AMMINOACIDO
Aspartato
Glutammato
Lisina
Arginina
Istidina
Asp
Glu
Lys
Arg
His
D
E
K
R
H
CARICA
+
+
+
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Altre classificazioni di amminoacidi
AA acidi:
glutammato e aspartato: AA monoamminodicarbossilici
AA basici:
arginina e lisina:
AA diamminomonocarbossilici
istidina (anello imidazolico)
AA solforati:
cisteina e metionina
AA aromatici:
fenilalanina, triptofano e tirosina
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GLUTAMMATO MONOSODICO (MSG) *
casa
* aumenta il sapore dei cibi
dadi
ristorante
Amminoacidi
proteine
GLUTAMMATO
Neurotrasmettitore
(versatilità delle biomolecole, principio di economia)
Idrolizzati proteici vegetali (dadi) > 40% di MSG
Sindrome da ristorante cinese
dai capogiri al mal di testa all’affaticamento
(eccessivo uso di MGS)
2% popolazione umana estremamente sensibile
Esempio di amminoacido
evitare : questo condimento
funghi
piselli
altri vegetali ricchi in MSG
utile all’organismo
dannoso in quantità eccessiva
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AMMINOACIDI RARI O NON-STANDARD (prodotti dalla modificazione post-traduzionale)
4-idrossiprolina
proteine fibrose = collageno
non idrossilazione = scorbuto
γ - carbossiglutammato
Protrombina
non carbossilazione = emorragia
Selenocisteina (derivato della serina)
Si ottiene dalla sostituzione dell’
OH ossidrilico Ser con Selenio. E’
presente
nella
glutatione
perossidasi e in poche altre
proteine.
Cistina
Si ottiene dalla ossidazione del
gruppo sulfidrilico di due cisteine
con formazione di un ponte
disolfuro
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AMMINOACIDI NON-PROTEICI – circa 300 nella cellula
β - alanina
(acido pantotenico)
δ
γ
β
α
ornitina
(ciclo dell’urea)
δ
citrullina
γ
β
α
(ciclo dell’urea)
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AMMINOACIDI ESSENZIALI
Amminoacidi che l’organismo non può sintetizzare o sintetizza in quantità insufficiente. Per
l’uomo sono 10 di cui
8 per tutta la vita
2 solo per il bambino
Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val
Arg e His
per tutta la vita
nell’infanzia (rapida crescita)
durante la gravidanza
Tyr
solo per i fenilchetonurici
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STEREOCHIMICA DEGLI αAMMINOACIDI
Tutti gli α-amminoacidi, tranne la glicina che non ha C chiralico, ruotano il piano
della luce polarizzata
Centro chiralico = Carbonio con 4 sostituenti diversi = otticamente attivo
Poichè la disposizione degli orbitali di legame intorno al Cα è tetraedrico i 4 gr
sostituenti possono disporsi nello spazio in 2 modi diversi e quindi gli AA
presentano 2 possibili stereoisomeri.
Questi stereoisomeri sono immagini speculari non sovrapponibili = eniantiomeri
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CONFIGURAZIONE ASSOLUTA DEGLI AA : D, L
La configurazione assoluta non fa riferimento alle proprietà ottiche delle
molecole ma solo alla configurazione secondo la convenzione di Fisher dei
quattro sostituenti attorno a 1 C chiralico.
D–
configurazione assoluta
L–
Il Cα è il C asimmetrico = centro chirale = tutti i sostituenti del C sono diversi.
Convenzione di Fisher
da: Nelson & Cox
M.N. Gadaleta
CONFIGURAZIONE RELATIVA
ROTAZIONE SPECIFICA [α]
25
D =
rotazione oss. (deg x 100)
lungh. camm. ott. (dm) x conc. (gr/100ml)
D = linea del Na 589.3 nm
[α]
AMMINOACIDI
L-alanina
L-arginina
L-leucina
L-isoleucina
L-fenilalanina
L-ac. Glutammico
+1.8
+12.5
-11.0
+12.4
+34.5
+12.0
D
25
configurazione relativa:
Destrogiri + d)
Levogiri
- l)
Rotazione specifica di alcuni amminoacidi isolati da proteine, in soluzione acquosa.
Dipende dalla natura di R,
non dipende dalla configurazione assoluta
del C asimmetrico
sono tutti L stereoisomeri
. Il grado e il segno di
rotazione specifica dipendono dal
pH.
M.N. Gadaleta
M.N. Gadaleta
Stereoisomeri : Enantiomeri
proprietà fisiche e chimiche identiche ad
eccezione:
rotazione del piano della luce
1.
polarizzata in misura uguale ma
direzione opposta
reagiscono in modo diverso con
2.
reagenti a loro volta asimmetrici
(ENZIMI)
Stereoisomeri possibili
se prodotti da una
reazione
organica gli amminoacidi sono
ottenuti sotto forma di racemo
L-D
Se sintetizzati con reazioni
enzimatiche si ottengono solo
gli isomeri L, perché gli enzimi sono
anch’essi asimmetrici.
2n
n = n 0 di C asimmetrici
Glicina
n=0
Treonina e isoleucina
n = 2 (4 possibili
stereoisomeri)
M.N. Gadaleta
SPETTRI DI ASSORBIMENTO DEGLI AMMINOACIDI
Gli amminoacidi non assorbono nel visibile
Tutti gli amminoacidi assorbono nell’estremo U.V. < 220 nm a causa del doppio legame del gruppo COOH
Tre amminoacidi assorbono nell’ U.V. intorno a 280 nm; Trp
BANDA DEL TRIPTOFANO
Tyr
Phe
Queste caratteristiche si riflettono nelle proteine che possono essere dosate attraverso lettura
spettrofotometrica a 280 nm.
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LEGGE DI LAMBERT BEER
Legge valida solo ad A = Aλmax
l = percorso ottico
(A)
A λ max = ε c l
ε=
coefficiente di
estinzione molare
c = concentrazione
sostanza in esame
A = log I0/ I t
I0 = intensità luce
incidente
nell’U.V.
It = intensità luce
(Aλmax)
da: Nelson & Cox
trasmessa
M.N. Gadaleta
PROPRIETA’ ACIDO-BASICHE DEGLI AMMINOACIDI
Gli amminoacidi cristallini hanno :
1. punto di ebollizione >> 200 0C
2. alta solubilità in acqua
Queste proprietà sono tipiche dei reticoli cristallini di molecole dotate di carica le cui forze
attrattive sono di tipo elettrostatico; viceversa sarebbero stati stabilizzati da forze di Van
der Waals, più deboli, e quindi avrebbero avuto punti di fusione più bassi.
Gli amminoacidi cristallizzano come ioni dipolari o zwitterioni e si trovano in questa forma
anche in soluzioni acquose neutre. Gli amminoacidi hanno infatti:
1.
alte costanti dielettriche D
2.
grandi momenti dipolari
un riflesso di cariche sia positive che negative sulla stessa molecola.
M.N. Gadaleta
STATI DI IONIZZAZIONE DI UN AMMINOACIDO IN FUNZIONE DEL pH
Gli amminoacidi disciolti in acqua possono comportarsi:
come ACIDI (donatori di protoni)
come BASI (accettori di protoni)
sono chiamati ELETTROLITI ANFOTERI o ANFOLITI
M.N. Gadaleta
Un semplice amminoacido mono amino-monocarbossilico, come la GLICINA, è di fatto un acido diprotico quando è
completamente protonato, in questa forma ha, cioè, due gruppi che possono ionizzarsi per dare protoni.
La CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA presenta due distinti stadi, corrispondenti
ciascuno alla rimozione di un protone.
M.N. Gadaleta
da: Nelson & Cox
all’inizio della titolazione la Glicina è nella forma completamente protonata
al punto di flesso della Ia sigmoide sono presenti quantità equimolecolari di COO- e
COOH; questo pH è il pK del gruppo che viene titolato. (pK1 = 2.34)
a pH = 5.97 è completa la titolazione del primo gruppo e si inizia a rimuovere il
secondo protone. La forma prevalente è NH3-CHR-COO-
al punto di flesso della IIa parte si avrà quantità equimolecolare di –NH3+ e –NH2.
Questo pH è il pK del gruppo –NH3+ (pK2 = 9.60)
la titolazione è completa quando la forma predominante diventerà NH2-CHR-COO(completamente deprotonata)
M.N. Gadaleta
La curva di titolazione predice la carica elettrica degli AA
A pH = 5.97 la forma prevalente è lo ZWITTERIONE (cioè senza carica netta). Questo pH è detto PUNTO
ISOELETTRICO (pI) ed è dato dalla media aritmetica dei due valori di pK (nel caso di amminoacidi privi di gruppi R
dissociabili).
Es. Glicina ⇒ pI = 2.34 + 9.60 / 2 = 5.97
a pH = pI di un amminoacido
pI = pK1 + pK2
2
1. carica netta = 0
2. non si muove in un campo elettrico
3. presenta la minima solubilità
a pH > pI
la carica netta della Glicina sarà -, pertanto si muoverà verso il polo +
a pH < pI
la carica netta della Glicina sarà +, pertanto si muoverà verso il polo –
a pH = 1
la Glicina sarà completamente protonata con carica netta + = 1
a pH = 2.34
dove [NH3+-CHR-COOH] = [NH3+-CHR-COO-], la Glicina avrà carica netta + = 0.5
così per tutti i valori di pH si può calcolare la frazione di carica netta posseduta dall’amminoacido.
Importante per la separazione elettroforetica.
M.N. Gadaleta
Gli amminoacidi con gruppi R ionizzabili hanno curve di titolazione più complesse con tre
stadi corrispondenti alle tre tappe di ionizzazione, con tre valori di pK.
Se i valori di pK sono molto simili le curve si fondono.
La curva di titolazione dell’istidina. Il pH isoelettrico (pI) è il valore al quale ci sono
un ugual numero di cariche positive e negative.
La molecola non ha carica netta.
pI = 7.6 = pK2 + pKR
2
M.N. Gadaleta
VALORI DI pKA DI ALCUNI AMMINOACIDI E LORO pI
AMMINOACIDI
PK1
-COOH
PK2
-NH3
Glicina
Alanina
Leucina
Serina
Treonina
Glutamina
a. aspartico
a. glutammico
Istidina
Cisteina
Tirosina
Lisina
Arginina
2.34
2.34
2.36
2.21
2.11
2.17
1.88
2.19
1.82
1.96
2.20
2.18
2.17
9.6
9.69
9.6
9.15
9.62
9.13
9.60
9.67
9.2
8.18
9.11
8.95
9.04
PKR
3.65
4.25
6.0
8.28
10.07
10.53
12.48
PI
5.97
6.02
5.98
5.68
5.87
5.65
2.77
3.22
7.6
5.07
5.66
9.74
10.76
nessun amminoacido mono amino mono carbossilico ha capacità tamponante nelle
zone di pH fisiologico (7.4) da 6.0 a 8.0 tranne l ‘ISTIDINA il cui pKR è = 6. E’ un
amminoacido raro ma molto importante (per es. in Hb e nel sito attivo degli enzimi)
il pI degli amminoacidi acidi è uguale a pK1 + pKR
2
il pI degli amminoacidi basici è uguale a pK2 + pKR
2
M.N. Gadaleta
In pratica, a pH fisiologico l’istidina può associare e dissociare il
protone con la stessa facilità. Può pertanto comportarsi da acido o
da base: dipende dall’ambiente circostante. Importante in Hb e
nella catalisi acido-basica.
M.N. Gadaleta
GENERALITA’ sulle proprietà acido-basiche degli AA
il pI degli amminoacidi neutri non è esattamente 7 (come ci si aspetterebbe se –COOH e –NH2 avessero la
stessa forza), ma –COOH come acido è un pò più forte di –NH2 come base
il gruppo α – COOH è un acido più forte di altri gruppi carbossilici (es. acido acetico ha il pK = 4.76). Ciò è
dovuto alla repulsione che si instaura tra i protoni che vengono liberati e la carica positiva del gruppo α –
aminico (con le sue cariche + stabilizza la carica – del –COO- dissociato)
il pKa del gruppo aminico della Glicina viene modificato verso il basso rispetto ai valori medi di un gruppo
aminico primario: ciò è dovuto alla forza di attrazione degli atomi elettronegativi dell’ossigeno del -COOH,
aumentando contemporaneamente la tendenza del gruppo NH3 a cedere un H+
tutti gli amminoacidi mono amino mono carbossilici con gruppi R privi di carica hanno valori di pK1 quasi
uguali (1.8 - 2.4) così per i valori di pK2 (8.8 - 11). Le curve di titolazione sono simili a quelle della Glicina
il gruppo β - carbossilico dall’ a. aspartico e il γ - carbossilico dell’ a. glutammico sebbene completamente
ionizzati a pH 7 hanno valori di pK molto più alti dei gruppi α–COOH, cioè molto più simili a quelli degli
acidi carbossilici semplici come a. acetico
il gruppo –SH delle cisteine e il gruppo –OH della tirosina sono debolissimi acidi. A pH 7 –SH è ionizzato
all’8%, mentre l’-OH è ionizzato all’0.01%
Queste considerazioni sono importanti per spiegare, per esempio, il meccanismo di catalisi nel sito attivo
degli enzimi.
M.N. Gadaleta
Metodi per l’analisi qualitativa e quantitativa degli AA
1.
SEPARAZIONE e ANALISI QUALITATIVA degli AA
Tecniche basate sulle proprietà di adsorbimento e miscibilità (o
ripartizione)
1. cromatografia su carta
2. “
su strato sottile (TLC)
3.
“
liquida ad alta pressione (HPLC)
Principi in base ai quali operano le suddette tecniche:
1. principio di ripartizione
2.
“
di ripartizione o di adsorbimento
3.
“
di ripartizione o di adsorbimento (sc. ionico)
Tecniche basate sulle proprietà di carica
1. elettroforesi su carta
2. cromatografia a scambio ionico
2. ANALISI QUANTITATIVA
Analisi spettrofotometrica
1. “
colorimetrica
2. “
fluorimetrica
per tirosina, triptofano fenilalanina
(ninidrina fino a 1 µmole)
(fluorescamina fino a 1 pmoli)
(cloruro di dansile fino a 1 pmoli)
M.N. Gadaleta
Cromatografia su colonna
M.N. Gadaleta
Analisi degli amminoacidi
Reazione con la ninidrina per l’analisi quantitativa colorimetrica degli amminoacidi
La reazione con la ninidrina distrugge la molecola degli amminoacidi.
Il composto colorato si sviluppa dopo esposizione degli amminoacidi a 100°C.
La prolina, che è un imminoacido dà un composto giallo (λ
λmax = 440 nm).
Sensibilità: micromole (10-6moli); µg
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da: Nelson & Cox
M.N. Gadaleta
