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La regolazione dell’espressione genica
Uno stress fisico o emotivo molto forte (come una violenza)
durante la gravidanza può avere effetti negativi sul bambino a
molti anni di distanza… e tali effetti negativi possono anche
trasmettersi nelle generazioni
I ricercatori hanno verificato che adolescenti le cui madri avevano subito abusi durante la gravidanza
hanno livelli di metilazione del promotore per il recettore dei glucocorticoidi significativamente più alta.
I promotori sono importanti sequenze di DNA a monte della sequenza codificante, che controllano la
velocità di trascrizione. La loro elevata metilazione impedisce il legame con fattori di trascrizione,
diminuendo l’espressione del gene.
I glucocorticoidi sono ormoni importanti nel mantenimento dell’omeostasi e nella risposta a situazioni di
crisi (stress). Minore espressione del recettore, significa quindi minore capacità di risposta allo stress
Altri studi hanno verificato che anche persone che hanno subito abusi da bambini manifestano livelli di
metilazione più alta, con conseguenti risposte ormonali alterate allo stress e rischio più elevato di
suicidio
Nuovo campo di studio: epigenetica comportamentale
«Cambiamenti ereditabili nell’espressione genica che non implicano cambiamenti nella sequenza di DNA»
L’espressione genica inizia a
livello del promotore, dove si
lega l’RNA polimerasi
In un genoma con molti geni,
non tutti i promotori sono
attivi – trascrizione genica
selettiva
Presenza di proteine regolatrici
che legano il promotore per
regolare il gene
- Repressori impediscono la
trascrizione (regolazione
negativa)
- attivatori stimolano la
trascrizione (regolazione
positiva)
Per il corretto sviluppo di un
organismo pluricellulare e perché
ogni cellula acquisisca e mantenga la
propria specificità funzionale, certe
proteine devono essere prodotte al
tempo giusto e nel posto corretto.
L’espressione dei geni
eucariotici deve essere
regolata con molta
precisione
Meccanismi di regolazione negli
eucarioti simili a quelli di procarioti,
basati su interazioni DNA-proteine e
controlli negativi e positivi.
Esistono tuttavia molte differenze
principalmente imputabili alla
presenza del nucleo.
L’espressione genica può
essere regolata in molti
punti del processo di
trascrizione e traduzione
Fattori di trascrizione agiscono nei promotori
eucariotici… per regolare l’inizio della trascrizione
Promotore è sequenza di DNA vicino al 5’ della
regione codificante dove RNA polimerasi si lega per
inizio trascrizione
Vicino al sito di inizio – TATA box (ricco di AT) –
regione in cui DNA inizia a denaturarsi (esposizione
filamento stampo)
Promotori contengono anche sequenze regolatrici
multiple dove si legano fattori di trascrizione
1- fattori generali di trascrizione si assemblano sul
cromosoma (prima proteina TFIID che lega il TATA
box)
2- legame TFIID consente l’accesso di altri FT; si
forma un complesso di inizio della trascrizione
3- RNA polimerasi II si lega al complesso
4- dopo l’aggiunta di altri TF può partire la
trascrizione
TATA box sono comuni a promotori di molti geni che vengono
riconosciuti da fattori generali di trascrizione. Altre sequenze
sono riconosciute da FT specifici, presenti in certi tipi cellulari
o stadi del ciclo cellulare, o possono essere prodotti in risposta
a segnali cellulari o ambientali
Proteine specifiche riconoscono e si legano a una sequenza di DNA e ne regolano
la trascrizione
Sequenza regolatrici positive – enhancers (intensificatori)
Legano fattori di trascrizione che attivano la trascrizione o ne aumentano
la velocità
Sequenze regolatrici negative – silencers (silenziatori)
Legano fattori che reprimono la trascrizione
La combinazione dei fattori di trascrizione presenti in una data cellula
e in un dato momento determina la velocità finale di trascrizione
In che modo i fattori di trascrizione riconoscono specifiche sequenze di DNA?
Interazioni specifiche
tra DNA e proteine
Basi azotate formano legami idrogeno tra di loro, ma possono formare legami
idrogeno anche con proteine nei siti esposti dei solchi maggiore e minore
Una proteina
- che si adatti al solco maggiore o minore
- abbia aa che si proiettano verso l’interno della doppia elica
- abbia aa che possano formare legami idrogeno con basi azotate interne
è un buon candidato per essere un fattore di trascrizione
Ad esempio, se questa proteina è un
repressore, può inibire la trascrizione
impedendo il legame al DNA di altre
proteine che fungono da fattori di
attivazione della trascrizione
Molti repressori possiedono il motivo
elica-giro-elica
Proteine di regolazione
L’espressione di fattori di trascrizione specifici è alla base del differenziamento cellulare
Tutte le cellule differenziate contengono un
genoma completo. Le loro caratteristiche
specifiche sono dovute a espressioni
geniche differenziali
Le funzioni specializzate sono mediate da fattori di
trascrizione.
Alterando l’espressione di fattori di trascrizione si
può determinare il destino di una cellula staminale.
Come fanno le cellule a coordinare la regolazione di parecchi geni simultaneamente?
I geni eucariotici hanno promotori
separati e possono essere a
notevole distanza…
… ma possono avere in comune
sequenze regolatrici che legano gli
stessi FT
Un singolo segnale (ambientale)
causa la sintesi di un fattore di
trascrizione che agisce su molti geni
I cambiamenti epigenetici regolano l’espressione genica
Epigenetica
… ieri
La branca della biologia che studia le interazioni causali fra i geni e il loro prodotto
cellulare che pongono in essere il fenotipo (C.H. Waddington)
… oggi
Studio dei cambiamenti dell’espressione genica che avvengono senza
cambiamenti nella sequenza di DNA.
Metilazione del DNA
Modificazione proteine istoniche
Questi cambiamenti sono in genere reversibili, ma talvolta diventano stabili e ereditabili
La metilazione del DNA avviene a livello dei
promotori e silenzia la trascrizione
DNA metiltransferasi aggiunge un gruppo –
CH3 alle C di regioni ricche in doppiette CG
(isole CpG) – abbondanti nei promotori
Metilasi di mantenimento catalizzano la
formazione di 5’metilcitosina nel nuovo
filamento di DNA durante la replicazione cambiamenti ereditabili
Demetilasi catalizza rimozione gruppo
metilico dalla C, contrinuendo alla
reversibilità e alterazione del pattern di
metilazione.
Gruppi –CH3 extra in un promotore
attraggono proteine che reprimono la
trascrizione
Geni fortemente metilati
tendono ad essere inattivi
Modificazioni delle proteine istoniche influenzano la trascrizione
… alterazione della struttura
(rimodellamento) della cromatina
Proteine istoniche dei nucleosomi hanno
code N-terminali che contengono lisina
(aa carico positivamente) – interazioni
ioniche con DNA carico negativamente –
Impacchettamento del DNA
Enzimi istone acetiltransferasi
aggiungono gruppi acetile a lisina,
riducendo carica positiva – diminuzione
affinità per DNA
Nucleosoma si apre – DNA
disponibile per trascrizione
Istone acetiltransferasi possono quindi attivare la trascrizione
… istone deacetilasi rimuovono gruppi acetile da istoni e reprimono la trascrizione
Effetti sono reversibili – attività geni eucariotici può essere regolata da complessi pattern di
modificazioni istoniche
I cambiamenti epigenetici possono essere indotti dall’ambiente
Gemelli monozigoti hanno genomi identici
Fino a pochi anni di età il pattern di metilazione del DNA è molto simile
A 50 anni, quando i gemelli hanno vissuto per molti decenni in ambienti diversi, il
pattern di metilazione è molto diverso
L’ambiente gioca un
ruolo importante
nelle modificazioni
epigenetiche
VOLUME 41 NUMBER 2 FEBRUARY 2009 NATURE GENETICS
Methods Mol Biol. 2012;863:359-76. doi: 10.1007/978-1-61779-612-8_23.
Dietary and lifestyle factors of DNA methylation.
Lim U, Song MA.
Abstract
Lifestyle factors, such as diet, smoking, physical activity, and body weight management, are known to constitute the
majority of cancer causes. Epigenetics has been widely proposed as a main mechanism that mediates the reversible
effects of dietary and lifestyle factors on carcinogenesis. This chapter reviews human studies on potential dietary and
lifestyle determinants of DNA methylation. Apart from a few prospective investigations and interventions of limited
size and duration, evidence mostly comes from cross-sectional observational studies and supports some associations.
Studies to date suggest that certain dietary components may alter genomic and gene-specific DNA methylation
levels in systemic and target tissues, affecting genomic stability and transcription of tumor suppressors and
oncogenes. Most data and supportive evidence exist for folate, a key nutritional factor in one-carbon metabolism that
supplies the methyl units for DNA methylation. Other candidate bioactive food components include alcohol and other
key nutritional factors of one-carbon metabolism, polyphenols and flavonoids in green tea, phytoestrogen, and
lycopene. Some data also support a link of DNA methylation with physical activity and energy balance. Effects of
dietary and lifestyle exposures on DNA methylation may be additionally modified by common genetic variants,
environmental carcinogens, and infectious agents, an aspect that remains largely unexplored. In addition, growing
literature supports that the environmental conditions during critical developmental stages may influence later risk of
metabolic disorders in part through persistent programming of DNA methylation. Further research of these
modifiable determinants of DNA methylation will improve our understanding of cancer etiology and may present
certain DNA methylation markers as attractive surrogate endpoints for prevention research. Considering the plasticity
of epigenetic marks and correlated nature of lifestyle factors, more longitudinal studies of healthy individuals of
varying age, sex, and ethnic groups are warranted, ideally with comprehensive data collection on various lifestyle
factors.
La metilazione del DNA può produrre imprinting genomico (o parentale)
Nei mammiferi, quando si formano i gameti,
si producono nuovi pattern di metilazione,
che differiscono nei due sessi (spermi vs
uova) in circa 200 geni.
Un dato gene può essere metilato nelle
uova e demetilato negli spermi.
La progenie erediterà un gene materno
trascrizionalmente inattivo (metilato) e
uno paterno attivo (demetilato)
Imprinting genomico
Un esempio di imprinting genomico riguarda la
regione 15q11 (sul cromosoma 15 umano).
Questa regione subisce imprinting genomico
durante formazione dei gameti e in rari casi si
assiste a una delezione cromosomica in uno dei
due gameti
La progenie erediterà quindi pattern di
imprinting o solo maschile o solo femminile
Sindrome di Prader-Willi
- Se presente solo pattern maschile si sviluppa
sindrome di Angelman (epilessia, tremori,
sorriso costante)
- Se presente solo pattern femminile bambino
sviluppa sindrome di Prader-Willi (debolezza
muscolare e obesità)
Le sequenze geniche sono le stesse, è il pattern epigenetico che è diverso
Che cosa è e come si manifesta la sindrome di Angelman?
La sindrome di Angelman è una malattia genetica caratterizzata da un ritardo nello
sviluppo e gravi danni neurologici. Questi bambini appaiono normali alla nascita, ma tra i
6 e i 12 mesi cominciano a mostrare problemi di alimentazione e ritardo nello sviluppo.
Intorno ai 2-3 anni possono comparire crisi epilettiche. Il loro comportamento è
caratterizzato da iperattività e scarsa soglia d’attenzione. In età adulta continuano a
mostrare problemi cognitivi, difficoltà nella comunicazione e attacchi epilettici, talvolta
anche una curvatura anormale della colonna vertebrale. L’aspettativa di vita è normale; in
rari casi durante l’invecchiamento si può avere un ulteriore regressione nello sviluppo.
Come si trasmette la sindrome di Angelman?
La malattia è dovuta a un difetto nella copia materna del gene UBE3A, che contiene le
informazioni per un enzima chiave del processo di degradazione delle proteine. La
perdita della sua funzione sembra sufficiente a causare la malattia. Nella maggior parte
dei casi la sindrome di Angelman non è ereditaria, ma l’alterazione genetica insorge in
modo sporadico durante la formazione delle cellule riproduttive. Di conseguenza, le
persone affette dalla sindrome normalmente non hanno una storia familiare della
malattia.
Cos'è e come si manifesta la sindrome di Prader-Willi?
La sindrome di Prader-Willi è una malattia genetica molto eterogenea, sia dal punto di
vista clinico sia da quello genetico. Si manifesta già alla nascita con una grave ipotonia, che
comporta problemi alla deglutizione e all’allattamento. A partire dai due anni di età il
bambino affetto mostra invece una costante assenza di sazietà (iperfagia) la quale, se non
controllata, può portare a obesità grave. La malattia è inoltre associata a difficoltà di
apprendimento e a disturbi comportamentali (comportamento ossessivo-compulsivo
oppure manipolativo) e psichiatrici (difficoltà nell’ interpretazione e nell’uso appropriato
delle informazioni sociali, che comportano disturbi simili a quelli caratteristici dello spettro
autistico) di entità variabile. Sono state spesso segnalate caratteristiche facciali peculiari
come fronte stretta, occhi a mandorla, labbro superiore sottile e bocca rivolta verso il
basso, mani e piedi molto piccoli, scoliosi. Altre anomalie endocrine portano a bassa
statura, dovuta a deficit dell'ormone della crescita, e a uno sviluppo puberale incompleto.
Come si trasmette la sindrome di Prader-Willi?
La sindrome di Prader-Willi è dovuta ad anomalie a carico di geni presenti in una
particolare regione del braccio lungo del cromosoma 15 (15q11-q13) ereditato dal padre.
Questa regione, infatti, è sottoposta a un particolare fenomeno genetico chiamato di
imprinting parentale, per cui sono attivi solo i geni presenti nella regione ereditata da uno
dei genitori (in questo caso specifico il papà) ma non dall'altro (in questo caso la mamma).
Poiché i geni materni sono “spenti”, in caso di anomalie della regione di origine paterna si
manifesta la malattia. La maggioranza dei casi è sporadica (l'anomalia compare
all'improvviso nella persona affetta, senza essere presente nei suoi familiari), mentre i casi
familiari sono molto rari.
Una lezione dall’imprinting
Maschi e femmine possono essere uguali
geneticamente (eccetto per i cromosomi X e Y),
ma sono diversi epigeneticamente
La regolazione dell’espressione genica dopo la trascrizione
(meccanismi di controllo post-trascrizionali)
Splicing alternativo del pre-mRNA
Silenziamento genico a opera di
miRNA e siRNA
Repressione della traduzione
Regolazione della degradazione
proteica
Lo splicing alternativo consente di sintetizzare mRNA diversi dallo stesso gene…
e quindi proteine diverse
Dato l’enorme numero di proteine, si stimava che nell’uomo potessero esserci 80.000-150.000 geni. Con
il sequenziamento del genoma, si sono sequenziati solo ca 21.000 geni. Ci sono molti più mRNA che geni,
che derivano da splicing alternativo
Almeno 5 modi diversi di fare splicing alternativo
Singoli siti di splicing possono essere attivati o saltati. Il controllo è esercitato da
proteine regolatrici e snRNA, che si legano a sequenze enhancer o silencer dello splicing
nei pre-mRNA
In tessuti diversi il gene della tropomiosina va incontro a splicing alternativo dando
origine a cinque forme differenti della proteina
Cos'è e come si manifesta la disautonomia
familiare
La disautonomia familiare è una è una malattia
ereditaria debilitante progressiva caratterizzata
da disfunzione del sistema nervoso autonomo,
che si manifesta già durante la prima infanzia.
Gli individui colpiti mostrano ritardo dello
sviluppo motorio dovuto a ipotonia, disfunzioni
gastrointestinali, problemi della deglutizione,
crisi di vomito, polmoniti ricorrenti, sensibilità
ridotta al dolore e alla temperatura, disturbi
cardiovascolari e assenza di lacrimazione. Sono
frequenti cifoscoliosi e bassa statura.
L'aspettativa di vita è ridotta.
Come si trasmette la disautonomia familiare:
La malattia è causata da mutazioni del gene
IKBKAP, localizzato sul cromosoma 9 e che
subisce uno splicing alternativo nei tessuti del
sistema nervoso. Si trasmette con modalità
autosomica recessiva: i genitori sono portatori
sani della mutazione, mentre ciascun figlio
della coppia ha il 25% di probabilità di essere
malato.
Cifoscoliosi in sindrome di Riley-Day
(disautonomia familiare)
Consigli di lettura (e studio): Il genoma alternativo di Gil Ast, Le Scienze 443/luglio 2005
• Solo il 5% circa del genoma codifica per proteine
• Parte del genoma codifica per tRNA e rRNA
• Fino a poco tempo fa si credeva che il resto del genoma non venisse
trascritto – DNA spazzatura (junk DNA)
• Recentemente si è dimostrato che alcune di queste regioni vengono
trascritte (sia nei procarioti sia negli eucarioti) – RNA molto piccoli,
microRNA (miRNA)
• Al momento sono conosciuti ca 5000 miRNA, codificati da ca 1000
regioni del genoma
• miRNA costituiti da 20-22 basi
I piccoli RNA sono
regolatori importanti
dell’espressione genica
I miRNA sono trascritti come
precursori più lunghi che si
ripiegano in RNA a doppia elica
Questi RNA vengono processati
in microRNA a singolo
filamento
Un complesso proteico guida il
miRNA fino al suo mRNA
bersaglio, dove viene inibita la
trascrizione
Meccanismo di silenziamento
genico molto conservato – molto
antico evolutivamente
I microRNA (miRNA) sono piccoli (ca 22 basi) RNA non codificanti che hanno un ruolo chiave
nella regolazione del genoma. Diversi studi hanno dimostrato che i miRNAs partecipano alla
modulazione di numerosi processi sia fisiologici che patologici a livello dell’intero
organismo. Negli ultimi anni evidenze crescenti hanno mostrato un ruolo importante dei
miRNA nello sviluppo e nell’omeostasi del sistema nervoso centrale. È stato riportato che i
miRNA costituiscono un elemento chiave nello sviluppo e nella funzionalità delle sinapsi e
nel controllo locale dell’espressione proteica, con importanti implicazioni in processi di
neurogenesi, differenziamento e sopravvivenza neuronale. Inoltre alcune evidenze hanno
dimostrato che i miRNA sono alterati in malattie neuropsichiatriche.
Convergent downregulation of miRNAs in schizophrenia patients and Df(16)A+/- mice
HPC, hyppocampus; PFC, pre-frontal cortex
Conclusions (Xu et al.)
… miRNAs play an important role in the pathogenesis and pathophysiology of
psychiatric and neurodevelopmental disorders as well as cognitive dysfunction.
Although the exact mode of action of individual miRNAs affected in various psychiatric
conditions remains largely unclear, our understanding is rapidly improving by the
convergence of findings from various recent studies, including ones involving carefully
designed animal models. A comprehensive understanding of the roles of miRNAs will
be important for determining whether miRNAs related pathways could serve as novel
targets for drug development for these devastating conditions.
La regolazione dell’espressione genica attraverso i miRNA è attualmente uno
degli aspetti più promettenti nella ricerca dei meccanismi e di possibili cure
per il cancro, le malattie cardiocircolatorie e le patologie neuropsichiatriche
Spesso non esiste una chiara correlazione tra la quantità di mRNA e di proteina nella cellula
A volte ci sono molti mRNA e poche proteine
Le cellule hanno due modi per controllare la quantità di proteina dopo la trascrizione
Regolare la traduzione
dell’mRNA in proteina
Diversi modi possibili:
- miRNA
-Modificazione del cap di GTP in 5’
- repressori proteici che bloccano
direttamente la traduzione
Regolare la longevità
proteica
La repressione della traduzione
riboswitch
Es. repressione della traduzione della
ferritina (proteina globulare
responsabile dell’immagazzinamento
del Fe) a opera di un repressore che
lega una regione a forcina dell’mRNA
(ribointerruttore o riboswitch)
Quando aumenta concentrazione, Fe2+
si lega al repressore, de-reprimendo la
traduzione.
La regolazione della longevità proteica
- degradazione delle proteine -
Un enzima attacca proteina di 76 aa (ubiquitina) alla proteina da degradare
Si forma una catena di poliubiquitina riconosciuta da un proteasoma
ATP viene utilizzata per svolgere la proteina bersaglio e 3 diverse proteasi la idrolizzano
Esempio: degradazione delle cicline