Articolo 1 savoia - Imprintaonline.it

Articolo 1: American journal of human genetics 2006
Trombocitopenia in assenza di Radio (TAR). E’ una malattia rarissima (circa 70-80 casi al mondo
documentati! Ciò è un limite in quanto posso studiare pochissimi pazienti.) caratterizzata da…
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Assenza bilaterale del radio. La mano c’è ma si sviluppa peggio e lentamente.
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Aplasia dell’ulna dell’omero (fenotipo più grave: le mani sporgono dal busto, quindi
focomelia)
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Tombocitopemia (meno di 50 piastrine per nano/litro)
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Anomalie cardiache
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Intolleranza al latte vaccino
N.B I fenotipi sono variabili!!!!
1. In letteratura fino a poco tempo fa emergeva che l’ereditarietà di questa malattia è di tipo
autosomico recessivo. Il primo obiettivo di questo studio è stato quindi quello di andare a
verificare ciò. In teoria, se ciò fosse vero…
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I genitori di un probando dovrebbero essere sani
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I fratelli in generale dovrebbero essere sani
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L’incidenza della malattia dovrebbe essere maggiore in caso di matrimoni tra consanguinei
Andando ad analizzarle famiglie di diversi probandi è stato però dimostrato che l’incidenza della malattia
non è maggiore nei matrimoni tra consanguinei, quindi l’ipotesi della recessività di questa malattia si tende
ad escluderla.
1. Si sono trovate tuttavia famiglie in cui la mutazione veniva trasmessa anche per 2 o 3
generazioni (genitori e figli affetti). Come si può spiegare questo?
Per fare questo studio sono stati analizzati 30 pazienti provenienti da tutto il mondo. La prima cosa che si è
fatta è stata andare a sequenziare determinati geni candidati, ovvero geni già conosciuti che se mutati si sa
danno fenotipi simili a quello della TAR. Esempi di questi geni sono:
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Gene per il recettore della Trombopoietina: Se mutato da una forma gravissima di
trompocitopenia (assenza totale di megacariociti).
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OXA 11: Se mutato da piastrinopenia e fusione del radio con l’ulna (fenotipo molto molto
simile alla TAR). Poiché è un ottimo gene candidato è stato il primo ad essere stato
analizzato.
Non si sono però riscontrate mutazioni a carico di questi geni!
1. E’ quindi stato svolto il cariotipo: i geni dei pazienti sono stati colorati con Giemsa per
verificare la presenza di eventuali delezioni, amplificazioni, traslocazioni… >5 Mb. Non si è
trovato nulla
2. Si è solto quindi un CGH Array per verificare la presenza di microdelezioni e si è visto che
effettivamente era presente una microdelezione interstiziale (dovuta a 2 rotture) di 200 Kb
sul braccio lungo del cromosoma 1 (banda 1, sottobanda 2, sottosottobanda 2).
3. Si è quindi svolta un’analisi più specifica della regione effettuando una FISH su 20 pazienti
(linfociti), 50 familiari e altri 700 individui. Questi ultimi non presentavano la delezione.
Confermata invece la presenza della delezione di circa 500 Kb sul braccio lungo del cromosoma 1
nei pazienti. Si è inoltre visto che i segnali provenienti dalle FISH di pazienti con la delezione erano
di diversa intensità: a cosa può essere dovuto questo? (magari al fatto che i frammenti deleti sono
di dimensioni diverse??)
4. Si è svolta quindi una RT-PCR su 10 pazienti per confermare la presenza della delezione. I
primer utilizzati (11) andavano ad appaiarsi in punti diversi della regione deleta (ai lati e
all’interno, ovvero in corrispondenza degli 11 geni deleti conosciuti): ciò è servito per
verificare se la dimensione della regione deleta potesse essere variabile. Sebbene sia
risultato che effettivamente le dimensioni della regione deleta sono variabili (delezione più
comune da 500 Kb), si è visto che tutti i pazienti possedevano una microdelezione comune
di 200 Kb, contenente 11 geni (nelle delezioni da 500 Kb i geni persi sono 19).
!!! Non vi è correlazione tra la dimensioni del frammento genico perso e la gravità della malattia!!!
!!! Chi ha la micordelezione è emizigote per i geni contenuti nella regione deleta!!!
!!! Qual è la causa della microdelezione? Presenza di break points in prossimità della regione
deleta. Tali break points sono ricchi di sequenze ripetute e possono determinare crossing-over
diseguale!!!
5. Caratterizzazione dei punti di break point (ovvero dei punti di rotture e di fusione). Come?
Svolgo diverse RT-PCR con diversi primer. Vado poi a verificare il dosaggio dei vari geni (di
quelli contenuti nella regione deleta avremo una sola dose!!).
PROBLEMA: analizzando diversi familiari di probandi si è notato che alcuni genitori e fratelli sani di
probandi portavano la delezione in eterozigosi. Ma anche gli affetti portano la mutazione in
eterozigosi!! Come me lo spiego??
6. A questo punto non posso più associare direttamente la delezione di tutta la regione alla
malattia!! Probabilmente ad essere causa della malattia è la delezione di uno degli 11 geni
contenuti nella regione deleta minima da 200 Kb! Si è quindi proceduto con l’approccio dei
geni candidati:
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X1L: è omologo ad un gene deputato alla formazione degli arti posteriori nel pollo.
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BS3: regola la crescita ematopoietica. In particolare è coinvolto in una pathway che parte
dalla trombopoietina che lega il suo recettore il legame attiva una chinasi la chinasi
attiva statina STAT3. BS3 è il regolatore di STAT3!!
Si è notato che la delezione dei BS3 era presente sia negli individui affetti da TAR sia nei familiari
sani che presentavano la delezione. L’aploinsufficienza di BS3 non era quindi responsabile da sola
del fenotipo patologico!! Per confermare ciò si è provato a ripristinare in individui affetti il gene
BS3, ma questo non ha comportato ad un miglioramento dei sintomi. Quindi la delezione di BS3 da
sola non è in grado di giustificare l’insorgenza della malattia!!!
1. Si è quindi vagliata l’ipotesi che la delezione coinvolgesse una regione genica soggetta ad
Imprinting genomico ma anche questa ipotesi è stata scartata, in quando la trasmissione
della mutazione era di tipo sia materno che paterno.
2. Si è vagliata l’ipotesi della metilazione casuale degli autosomi(sorta di imprinting che
coinvolge gli autosomi): tale ipotesi non è stata esclusa ma non ci sono tuttavia evidenze
per confermarla (rimane un’ipotesi).
3. Un’altra ipotesi è quella dell’allelismo multiplo: anche questa ipotesi non può essere
scartata
4. Altra ipotesi
Ereditarietà digenica : la malattia si manifesta solo se l’allele mutato
(ovvero quello con la microdelezione nel nostro caso) è presente assieme ad un altro allele
mutato, diverso dal primo . Può essere di 2 tipi:
- I 2 loci concorrono per dare un fenotipo grave (i 2 geni portano a 2 fenotipi gravi che si sommano).
- I 2 loci collaborano tra loro (uno dà il fenotipo grave e l’altro lo aggrava ancora di più)
del modificatore”.
“Teoria
La “teoria del modificatore” è quella più accreditata per spiegare l’insorgenza della TAR. I
ricercatori pensano infatti che perché si manifesti la malattia sia necessaria la presenza
contemporanea sia della delezione sul braccio lungo del cromosoma 1 sia un polimorfismo a carico
di un altro gene. Se questo polimorfismo debba trovarsi in omozigosi o in eterozigosi perché
insorga TAR è ancora da chiarire!!!
Articolo 2: Nature 2012
Scopo: Qual’è quel polimorfismo che associato alla microdelezione sul braccio lungo del
cromosoma 1 provoca TAR?
Premesse: Su 55 casi analizzati 51 presentavano la delezione della regione minima di 200 Kb sul
cromosoma 1. Si sono quindi presi 5 di questi pazienti e si è andato a sequenziare TUTTO l’esoma
(metodo Sanger). In 4 di questi casi è stato trovato uno SNP nel 5’UTR del gene RBM8A, uno dei
geni della regione minima deleta (che nello studio precedente non era stato analizzato in quanto
non è direttamente coinvolto nella produzione di piastrine o nella produzione degli arti). Nell’altro
caso è stato trovato invece uno SNP sempre a carico del gene RBM8A, ma questa volta a livello del
primo introne. Poiché questo dato risultava interessante, si sono andati a genotipizzare tutti e 51 i
pazienti con la microdelezione e si è visto che di questi 39 portavano il polimorfismo al 5’UTR e 12
nel primo introne. Si può quindi affermare che affinchè si sviluppi TAR c’è bisogno della
microdeleione di 200 Kb a carico del cr 1 associata a uno di questi 2 polimorfismi?
Svolgendo un’analisi statistica sui dati ottenuti è emerso che sì, effettivamente c’è bisogno della
contemporanea presenza della microdelezione a carico del cromosoma 1 e di uno dei 2 SNP