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CE IVD
ThromboFIL
Kit per la di genotipizzare delle mutazioni G20120A nel
Fattore II, G1691A nel Fattore V, C677T
T ed A1298C
nell’MTHFR, polimorfismo 4G/5G IN PAI-1.
Il rischio di patologia cardiovascolare e trombosi venosa è determinato
inato sia da
d fattori ambientali
(età, gravidanza, etc.) sia da una predisposizione genetica. Mutazioni
ni nei geni del fattore V, nel
fattore II della coagulazione e nel gene della metilentetraidrofolato reduttasi (MTHFR) determinano suscettibilità alla trombosi.
Fattore V. E’ un cofattore per l’attivazione della protrom
protrombina (fattore II) a trombina. Il suo effetto è
normalmente inibito dalla proteina C attivata ch
che taglia il fattore V in corrispondenza
dell’aminoacido arginina in posizione
mutazione V R506Q (G1691A), denominata variante
ne 506. La mutaz
ensibile al tag
di Leiden, rende il fattore V non sensibile
taglio da parte della proteina C attivata e favorisce un
aumento di produzione della trombina con un effetto pro-coagulante che predispone alla trombosi con modalità di trasmissione ereditaria autosomico dominante. La resistenza alla proteina C
attivata che ne deriva è il maggiore fattore di rischio ereditario per lo sviluppo della trombosi
venosa. La presenza
eterozigosi della mutazione aumentaa di 5-10 volte il rischio trombosi
nza in et
ischio aumenta di 35 volte in associazione
ciazione all’assu
assunzione
nzione di ccontraccettivi.
ntraccettivi.
venosa; tale rischio
all’assunzione
q
e
S
i
D
o
tore II. La sua attivazione a trombina porta alla trasformazione
asformazione del fibr
Fattore
fibrinogeno in fibrina e
uindi alla form
ne in posizione 20210 (variante G20210A)
10A) si ass
quindi
formazione del coagulo. La mutazione
associa
aumento di circa il 30% dei livelli plasmatici di protrombina. La varian
variante genetica G2
G20210A,
con un au
localizzata nella regi
protrombina, è associata
ociata ad ele
regione non tradotta all 3’ del gene della protrom
elevati livelli
funzionale nel plasma
trombosi venosa.
di protrombina funzi
maa con conseguente
conse
co
aumentato rischio
aum
io di trombo
8C). La metilentetraidrofolat
metilentetraidrofolato redu
MTHFR (C677T e A1298C).
reduttasi è un’enzima coinvolto nella
trasformazione del 5-10 metilentetraidrofolato
metiltetraidrofolato che serve come donatore
aidrofolato in 5 meti
etilazione della omocisteina a meti
di metili per la rimetilazione
metionina tramite l’intervento della vitamina B12.
La variante genetica
etica comune C677T determina la sostituzione
tuzione della valina con una alanina in posizione 223 con conseguente riduz
riduzione di ci
circa il 50% della ssua normale attività enzimatica. La
presenza
nza di omozigosi ed eterozig
eterozigosi d
di MTHFR
HFR C677T può dunque comportare elevati livelli di
omocisteinaa nel sangue che ssono cconsiderati fattori di risc
rischio per malattia vascolare.
Recentemente,
ente,
e, una seconda
sec
muta
mutazione del gene MTHFR (A1298C) è stata associata ad una ridotta
attività enzimatica.
pazienti portatori della mutazione C677T, determina
atica. Q
Questa mutazione, in pazien
un'aumento deii livelli e
ematici di omocisteina.
M
PAI -1. E’ un membro della famiglia
SERPIN e si lega all’attivatore del plasminogeno tissutale (tPA)
am
inibendone l’ attivazione
conseguente diminuita fibrinolisi. Elevati livelli di questo inibitore
ne con co
sono stati associati ad
maggior rischio trombotico sia di tipo arterioso che venoso, specie nei
d un magg
soggetti fumatorii ed ipertesi. Il gene PAI-1 presenta un polimorfismo (SNP) di inserzione/delezione
di una singola G (4G/5G) aalla posizione -675 dal sito di inizio del gene. L’ allele 4G è stato associato
ad aumentatato
rischio trombotico in quanto correlato ad un aumento dell’attività. Si ritiene infatti
atato rischi
che il promotore
romotore ccon la mutazione 4G sia in grado di legare solo un enhancer mentre l’ allele 5G sia
in grado di lega
legare sia un enhancer che un suppressor.
MoDiSeq
TM
Molecular Diagnostic Sequencing
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ThromboFIL
Kit per la genotipizzazione delle mutazioni G20120A nel
Fattore II, G1691A nel Fattore V, C677T ed A1298C
nell’MTHFR, polimorfismo 4G/5G IN PAI-1.
Il kit è basato su una amplificazione in PCR Multiplex, purificazione dell’amplificato mediante reazione enzimatica con EXOSAP* e successiva reazione SnapShot/minisequencing
“single base extension” mediante Kit SnapShot Multiplex Ready Reaction Mix*. La chimica
è basata sull’estensione di una singola base dideossi di uno o più oligonucleotidi primers
non marcati. Ciascun primer si lega al templato complementare in presenza di un ddNTP
fluorescinato e Taq. La polimerasi estende il primer di un oligonucleotide aggiungendo un
singolo ddNTP nella posizione 3’.
L’interpretazione dei dati avviene mediante elettroforesi capillare su un sequenziatore
automatico, che consente di evidenziare e separare i prodotti di PCR come in Figura 1.
* non inclusi nel kit
A1298
Mut
A1298
WT
FII
WT
FII
Mut
C677
WT
C677 FV FV
Mut WT Mut
Pai-1 Pai-1
5G 4G
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Figura 1. Profilo elettroforetico di una corsa ottenuta con ThromboFIL Kit. I picchi elettroforetici relativi agli alleli wild type
e mutati di ciascuna delle cinque mutazioni indagate vengono separate per peso molecolare e visualizzate con colori differenti per una chiara e rapida interpretazione dei dati. Nell’ immagine è mostrato il profilo elettroforetico di un soggetto
eterozigote per la A1298C e per il Fattore V di Leiden (G1691A).
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ThromboFIL kit:
-Fornisce tutti i reagenti necessari per la PCR Multiplex
-Consente una analisi rapida, affidabile ed
economica
-Permette di interpretare i dati in modo semplice e
riproducibile
-Garantisce una specificità ed una sensibilità del
99,9%
MoDiSeq
Ogni kit da 50 determinazioni contiene:
- N°2 vials contenenti 1x Mix (2x580µl)
- N°1 vials contenente 5U/µl Hot- Rescue Plus
DNA Polymerase (1x20 µl)
- N°1 vials contenente diluition buffer (1x100µl)
- N°3 vials contenenti SNAP Primers (3x3.8µl)
Codice Prodotto: MDS-PTF-002
TM
Molecular Diagnostic Sequencing
