Clonaggio Saccharomyces

Clonaggio in Saccharomyces cerevisiae
ed altri funghi
• Il lievito: eccellente organismo modello per
lo studio e la funzione dei prodotti genici
eucariotici.
• Molti geni di lievito sono omologhi a quelli
umani. Per esempio gran parte di quelli
coinvolti nella divisione cellulare
Analisi dei trasformanti di lievito
Il destino del DNA introdotto nei funghi
• pYeLeu10: plasmide enterobatterico + segmento
di DNA di lievito col gene LEU2+. L’analisi dei
trasformanti evidenziò che in alcuni casi si era
avuto uno scambio reciproco tra l’allele LEU2+
del plasmide e quello Leu2- della cellula ospite,
anche se la maggioranza dei trasformanti
contenevano anche le sequenze di ColE1 e
presentavano l’allele LEU2+ o in linkage stretto
con l’allele originale Leu2- oppure in posizione
totalmente indipendente, anche su un cromosoma
diverso.
Vettori plasmidici utilizzabili nei
funghi
DNA eterologo in cellule di funghi in uno
stato extracromosomico: il vettore
plasmidico che lo veicola deve essere in
grado di replicarsi all’interno dell’ospite.4
tipi di diversi vettori: plasmidi episomici
(YEp), plasmidi replicativi (YRp), plasmidi
centromerici (YCp) e cromosomi artificiali
Plasmidi episomici
YEp24 è in grado di
replicarsi sia in E.coli
sia in lievito. I
marcatori per
l’ampicillina e per la
tetraciclina derivano
da pBR322 mentre
Ura3 proviene da
lievito
Plasmidi episomici, centromerici
e replicativi:vengono mantenuti nella cellula di
lievito come molecole circolari
• YAC. Integrando in vettori replicativi del
tipo YRp dei telomeri funzionali, Szostak e
Blackburn (1982) hanno fatto il I vettore in
grado di propagarsi sotto forma di molecola
lineare
Costruzione di
uno YAC
contenente un
frammento di
DNA di
grandi
dimensioni
ARS1,
sequenza di
replicazione
autonoma;
URA3 e
TRP1,
marcatori per
funzioni
selezionabili
in lievito
Promotori di lievito
UAS (sequenze di attivazione
poste a monte) ed URS
(sequenze di repressione)
A UAS si legano proteine di
controllo ad azione positiva;
a URS si legano proteine a
controllo negativo
Costruzione di
plasmidi mediante
ricombinazione
omologa in lievito:
pBR328 vie
digerito con Pvu e
PvuII, il frammento
contenente HIS3
viene trasformato
in lievito, assieme
al plasmide
Yep420
linearizzato con
EcoRI. La
ricombinazione
omologa avviene
tra i due frammenti
di DNA e porta alla
formazione di un
nuovo plasmide
che contiene sia
HIS3 sia URA3.
Tipi di vettori specializzati per Saccharomyces (YES) e per Pichia (pPICZ).
V5, Express, 6Xhis e c-myc codificano per epitopi che possono essere
facilmente individuati e purificati mediante cromatografia di affinità.
Surface display in lievito
• Anche S.cerevisiae può essere utilizzato per
analizzare in dettaglio la funzione di una
particolare proteina mediante esposizione
sulla superficie del lievito di proteine
eucariotiche nella loro conformazione
nativa
La tecnica del phage display si basa sull’utilizzo del recettore di superficie per
l’alfa agglutinina (Aga), una glicoproteina composta da 2 subunità, Aga 1 e 2p.
Nel surface display il gene di interesse viene inserito in corrispondenza
dell’estremità C-terminale di una copia del gene Aga2p posta sotto il controllo del
promotore GAL1 all’interno di un apposito vettore plasmidico.
Se il gene di interesse è stato clonato nella fase di lettura corretta, il suo prodotto
verrà espresso come proteina di fusione con la subunità Aga2p. Tale molecola
chimerica poi si associa con la subunità Aga1p sintetizzata sul cromosoma
cellulare lungo la via secretoria per essere esportata sulla superficie della cellula.
Metabolismo del galattosio e suo controllo in S. cerevisiae
• Nel lievito il galattosio viene trasformato in
glu 6 P attraverso una via metabolica
comune ad altri organismi. Enzimi chiave:
chinasi (GAL 1), una transferasi (GAL 7).
Una epimerasi (GAL10) ed una mutasi
(GAL5).
Regolazione dei geni del galattosio in lievito
SOVRAESPRESSIONE DI
PROTEINE
• I SISTEMI DI SOVRAESPRESSIONE
IMPIEGANO PROMOTORI FORTI, SIA
NATIVI CHE INGEGNERIZZATI. Il promotore
ideale deve poter essere regolato strettamente così che la fase di
crescita può essere separata da quella in cui avviene l’induzione. Un
promotore così è ad es. quello del gene GAL1, il più ampiamente
utilizzato. LA REGOLAZIONE DEL GALATTOSIO IN LIEVITO è
STATA STUDIATA ACCURATAMENTE ED è DIVENTATA UN
SISTEMA MODELLO PER L’ANALISI DELLA REGOLAZIONE
TRASCRIZIONALE NEGLINEUCARIOTI SUPERIORI.
Sistema a due ibridi
L’interazione tra la proteina da analizzare (esca) e
quella codificata da uno dei plasmidi derivati dalla
genoteca (preda), determina l’attivazione
trascrizionale di un gene reporter. Questa metodica
è divenuta uno dei principali strumenti per lo
studio delle interazioni proteina-proteina e
proteina-ligando
INTERAZIONE PROTEINE
MEDIANTE DOPPIO IBRIDO